CBX1在胃癌中的表达及与胃癌患者病理特征相关性的生物信息学分析*

吴 爽，张涛元，李 俏，曹三成，祝撷英△

1.西安交通大学附属西安市儿童医院检验科，陕西西安 710003；2.日照心脏病医院麻醉科，山东日照 276800

胃癌的恶性程度和病死率均较高，由于胃癌在早期缺乏特异性症状，导致其早期诊断率较低[1]。目前已发现许多基因参与了胃癌的发生、发展，但胃癌的发病机制仍未完全被揭示[2]。人类基因组中CBX家族共包含8个基因，均与异染色质、基因表达及生长发育等生物过程密切相关。生物信息学技术分析结果表明CBX1在肝细胞癌、乳腺癌等多种癌症中发挥重要作用[3]，然而其在胃癌中的作用机制仍不明确。

微阵列技术和生物信息学技术已被广泛用于鉴定基因组的表达水平，帮助识别与癌症相关的差异表达基因和相关信号通路[4]。本研究利用生物信息学技术，分析胃癌中CBX1的表达情况，探究CBX1与胃癌患者病理参数和预后的关联，聚焦其在胃癌中可能参与的生物学过程，提供胃癌早期诊断和预后相关的标志物。

1 材料与方法

1.1CBX1在转录水平表达差异的验证 利用Oncomine数据库[5]，比较CBX1在胃癌组织与正常胃组织中转录水平的表达差异，同时获取胃癌组织与正常胃组织中CBX1的研究数据，参数设置如下：t检验，P=0.01，变化倍数为1.5倍，基因等级为10%，类型为mRNA。利用GEPIA数据库中肿瘤基因组图谱与基因表达项目(GTEx)的数据，分析验证CBX1在正常胃组织与胃癌组织中的转录水平的表达差异，参数设置如下：方差分析，|Log2(FC)|最佳临界值为1.0，q=0.01。

1.2蛋白质印迹法(Western blot)验证CBX1在正常胃黏膜细胞GSE-1和胃癌细胞SGC7901中的表达差异 兔抗人CBX1(PA5-28448)抗体购自美国Invitrogen Ebioscience公司，GAPDH抗体购自英国Abcom公司。将等量的正常胃黏膜细胞GSE-1及胃癌细胞SGC7901接种于10 cm培养皿，培养48 h以后提取蛋白，检测浓度后，进行Western blot实验，以GAPDH为内参，分析两种细胞中CBX1蛋白表达水平的差异。

1.3免疫组化验证CBX1在正常胃组织和胃癌组织中的表达差异 在Human Protein Atlas[6]网站(https://www.proteinatlas.org)中，利用免疫组化数据，从蛋白表达水平验证CBX1在胃癌组织与正常胃组织中的表达差异，所用抗体为HPA031762。

1.4CBX1与胃癌患者临床病理参数的分析 利用UALCAN数据库[7]，分析CBX1的mRNA表达情况与胃癌患者的癌症分期和肿瘤分级之间的相关性。利用Kaplan Meier-Plotter在线分析工具，分析CBX1与胃癌患者总生存期(OS)的相关性。依据胃癌患者CBX1表达值的中位数，分为高表达和低表达2组，计算风险比、95%置信区间和相应P值，制作生存曲线。

1.5CBX1关联基因的筛选及富集分析 使用GEPIA数据库获取与CBX1在胃癌中具有相似表达的基因，应用STRING数据库[8]及Scytoscape[9]软件，构建并可视化蛋白质互作(PPI)网络；利用Metascape网站对相似基因进行基因本体(GO)富集分析；利用Starbase网站进行相似基因的京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。

1.6统计学处理 使用SPSS22.0统计软件对数据进行处理分析，各数据的比较采用t检验和方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CBX1的mRNA水平在胃癌组织的表达情况 Oncomine数据库分析显示：与正常组织比较，CBX1的mRNA水平在大多数肿瘤组织中高表达，见图1A；其中有6组数据显示CBX1的mRNA在胃癌组织中高表达，见图1B、表1。利用GEPIA数据库对胃癌中CBX1的mRNA表达情况加以验证，结果表明，CBX1的mRNA在胃癌组织高表达，见图1C。

表1 不同类型胃癌与正常胃组织CBX1转录水平的变化(Oncomine数据库)

2.2CBX1的Western blot结果 Western blot结果显示，CBX1在GSE-1细胞中的表达水平低于SGC7901细胞，即CBX1在胃癌细胞中高表达，见图2。

2.3CBX1的免疫组化结果 免疫组化结果显示，CBX1在正常胃组织中低表达，胃癌组织中高表达，见图3。

注：A为CBX1在多种肿瘤中的表达情况；B为6组胃癌数据中CBX1的表达情况；C为CBX1在胃癌组织与正常胃组织中mRNA表达情况。

图2 CBX1的Western blot结果

注：A为CBX1在正常胃组织中的表达情况；B为CBX1在胃癌组织中的表达情况。

2.4CBX1与胃癌患者病理参数的相关性分析 利用UALCAN数据库对CBX1进行胃癌患者临床病理参数相关性分析，结果显示在肿瘤分级中，正常组织vs.2级胃癌组织(P=1.56E-4)、正常组织vs.3级胃癌组织(P=4.12E-5)、1级胃癌组织vs.3级胃癌组织(P=0.00)的mRNA水平比较，差异有统计学意义，见图4A；在癌症分期中，正常组织vs.2期胃癌组织(P=9.98E-5)、正常组织vs.3期胃癌组织(P=5.58E-5)、正常组织vs.4期胃癌组织(P=9.46E-3)、3期胃癌组织vs.4期胃癌组织(P=4.22E-2)的mRNA水平比较，差异有统计学意义，见图4B。利用Kaplan Meier-Plotter在线分析工具进行CBX1与胃癌患者预后的相关分析，并绘制生存曲线图，结果显示：CBX1高表达组患者的生存率远低于CBX1低表达组，见图4C。

注：A为CBX1在不同的肿瘤分级中的mRNA相对表达水平；B为CBX1在不同癌症分期中的mRNA相对表达水平；C为CBX1表达与胃癌患者生存率的关系。

2.5CBX1在胃癌中的相似基因及其PPI网络构建 利用GEPIA数据库，在胃癌组织中共获得与CBX1表达有相似性的基因50个，在STRING网站中这些基因共构建出含有51个点，985条边的PPI网络，Cytoscape 的MCODE插件，获取其中相互作用程度最高的43个点，877条边组成的核心网络，见图5。

图5 CBX1的PPI可视化结果

2.6GO富集分析及KEGG通路富集分析 GO富集分析结果显示，43个基因的生物学功能主要聚集在组蛋白修饰、mRNA组装及染色体有丝分裂过程，见6A。KEGG通路富集分析发现，43个基因主要涉及的通路包括核糖体及氨基酸的生物合成途径，见图6B。

注：A为GO富集分析图；B为KEGG通路富集分析图。

3 讨 论

目前，分子生物标志物在疾病的诊断、预后和精准治疗中发挥重要的作用。随着检测技术和治疗手段的提高，胃癌发病率有所下降，但仍是世界范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤[10]。胃癌的危险因素主要包括幽门螺杆菌感染、不当饮食、不洁饮食及吸烟等，而早期诊断的缺乏和肿瘤的转移、扩散则是其主要致死原因[11]。因此，亟须探索更多的分子标志物用于胃癌的早期诊断和靶向治疗。

CBX1参与了染色质结构和基因表达的遗传调控过程[12]，有研究证实，CBX1能够在肝癌细胞中高表达，且其高表达与肝癌患者预后不良相关[3]；而在关于垂体瘤的一项研究中发现，高表达的CBX1能够导致垂体瘤的发生[13]；在前列腺癌中，CBX1高表达与组蛋白H3K3的甲基化密切相关[14]。本研究通过两组不同来源的数据库——Oncomine数据库及GEPIA数据库，发现CBX1的mRNA水平在胃癌组织中明显升高，之后利用Western blot和免疫组化实验发现CBX1蛋白在胃癌细胞SGC7901及胃癌组织中高表达，这些数据表明CBX1的高表达与胃癌有相关性。UALCAN数据库的临床数据分析显示，CBX1的mRNA表达在胃癌的不同分级、分期中均有差异，即随着肿瘤的发展，CBX1的mRNA水平也随之升高，预示着CBX1可以作为胃癌早期诊断及癌症进展的标志物。生存分析结果显示，CBX1高表达与胃癌患者的生存率相关，风险比高达2.09，提示CBX1可以作为胃癌预后不良的危险因素。通过寻找在胃癌中与CBX1有相似表达的基因，筛选出43个作用紧密的基因集，富集分析显示，这些基因主要参与组蛋白修饰、mRNA组装及染色体有丝分裂等生物过程，这与CBX1参与染色质结构和基因表达调控的功能类似，同时也与目前已经报道的组蛋白和染色体对肿瘤细胞的调控机制相吻合[13-14]。组蛋白的去乙酰化与肿瘤的发生、发展密切相关，组蛋白H3和H4的乙酰化修饰被证实参与了胃癌的发生。染色体的非整倍性是肿瘤细胞的常见特征，也是肿瘤发生的原因之一，而一些针对有丝分裂纺锤体聚合物的药物也早已被频繁地用来治疗各类肿瘤。

本研究应用生物信息学方法，分析了正常胃组织与胃癌组织中CBX1的表达差异，发现CBX1与胃癌的分级、分期和患者远期预后相关，并分析了CBX1在胃癌中可能参与的生物学过程，有助于进一步揭示胃癌发生、发展可能涉及的分子机制，为胃癌提供早期诊断和预后相关的标志物。但是，本研究有一定局限，缺乏有效的分子生物学实验，对这些基因在胃癌组织中的功能进行分析验证；同时，在进行CBX1与胃癌患者临床病理参数相关分析时，由于此数据分期与分级所纳入病例数较少，有可能对结果的准确性造成影响。尽管如此，本研究仍有利于全面深入了解胃癌的潜在分子机制，并为后续的分子生物实验提供指导。

综上所述，本研究通过生物信息学分析，阐明了CBX1的表达与胃癌发生及胃癌患者病理参数之间的相关性，初步证实了CBX1可作为胃癌早期诊断及预后的标志物。