心脏疾病标志物cTnT和H-FABP联合检测微流体测试卡的开发及评价*

孙雪梅，许 强，孙晓萌，王轶鹏，吕衍民，孙晓艳，孟凡达

山东省医学科学院基础医学研究所/山东第一医科大学，山东济南 250062

心脏疾病发病时急且危重，严重时会危及到患者的生命，心脏疾病生物学标志物应用于心脏疾病患者的早期检测能够帮助临床医生快速而准确地诊断，从而做出进一步的治疗决策，挽救患者的生命[1-7]。在心脏疾病发展的不同阶段患者血清中存在相应的标志物，直接或间接反映疾病状况。心肌肌钙蛋白(cTn)被视为心脏疾病诊断的“金标准”，广泛用于心脏疾病的诊断中[8-9]，cTn具有T、I、C 3种亚型，其中cTnT和cTnI是心肌特异性蛋白，但是，在心脏疾病患者胸痛发作后4～6 h内其反应敏感性相对较差。心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在发生心肌缺血或损伤时能够迅速穿透细胞膜释放到血液中，早期诊断灵敏度高[10]。临床上，进行cTn与H-FABP的联合检测能够结合2种标志物的优势，极大提高诊断的灵敏度和特异度。

即时检测(POCT)能够实现床旁诊断，在采样现场即刻进行分析，快速得到检测结果。微流体技术与POCT检测方法相结合在心脏疾病的临床诊断上已经得到了广泛的应用[11-15]。POCT应用于心脏疾病标志物的快速检测可辅助医生对患者采取及时的治疗措施，对个性化治疗的发展、医疗水平的提高、医疗费用的减控有重要意义。因此，建立一种低成本的，能够同时进行多种靶标快速检测的，灵敏度较高的心脏疾病标志物检测方法意义重大。

本研究建立了一种在自驱动微流体测试卡上快速联合检测心脏疾病标志物cTnT和H-FABP的方法。本研究建立的检测方法有特异性良好、检测时间短、检测结果准确等优点，实现了心脏疾病标志物的联合检测，能够满足临床需求，有良好的应用前景。现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 激光切割机购自美国Universal公司；Nano-Plotter超微量点样仪购自德国GeSim公司；鼓风干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司；冷冻离心机购自德国Sigma公司；多模式微孔板分析仪购自德国PerkinElmer公司；高聚合度有机玻璃板PMMA(1 mm)购自深圳鸿年金属材料有限公司；3M双面胶(100 μm)购自深圳凯诚兴科技有限公司。H-FABP抗原标准品、捕获抗体F2和标记抗体F1(2种不同的抗H-FABP单克隆抗体)、cTnT抗原标准品、捕获抗体T2和标记抗体T1(2种不同的抗cTnT单克隆抗体)均购自芬兰Hytest公司；羧基修饰Eu时间分辨荧光微球(200 nm)购自上海微测生物科技有限公司；吐温-20、硼酸、硼砂、氯化钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺(EDC)、戊二醛、小牛血清均购自北京欣经科生物科技有限公司；聚苯乙烯接枝马来酸酐、甲苯购自北京蓝弋化工产品有限责任公司；海藻糖购自日本林原公司；其他未提及试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水。

1.2缓冲溶液、稀释液等溶液的配制 (1)碳酸盐缓冲液的配制：称取无水碳酸钠1.59 g，碳酸氢钠2.93 g，用超纯水溶解至900 mL，使用0.1 mol/L盐酸和0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为9.60后，定容至1 000 mL。(2)捕获抗体点样缓冲液的配制：称取海藻糖1 g，使用pH值为9.60的碳酸盐缓冲液溶解至10 mL。(3)2-N-吗啉代-乙基磺酸(MES)缓冲液的配制：称取MES 10.6 g，用超纯水溶解至450 mL，使用0.1 mol/L盐酸和0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为5.80后，定容至500 mL。(4)硼酸缓冲液的配制：称取硼酸4.02 g，硼砂3.34 g，氯化钠0.95 g，用超纯水溶解至450 mL，用0.1 mol/L盐酸和0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为8.20后，定容至500 mL。(5)标记抗体微球稀释液的配制：称取蔗糖2 g，牛血清清蛋白0.20 g，吐温-20 100 μL，使用pH值为8.20硼酸缓冲液溶解至10 mL。

1.3时间分辨微球的标记 取50 μL荧光微球，使用pH值为5.80的MES缓冲溶液清洗，11 000 r/min离心5 min去除上清液，将微球使用500 μL MES缓冲液超声重悬；加入10 μL EDC(50 mg/mL)溶液，室温反应20 min；11 000 r/min离心5 min去除上清液，使用pH值为8.20的硼酸缓冲液超声重悬微球至500 μL；加入50 μg标记抗体，室温振荡反应2 h；加入50 μL含10% 牛血清清蛋白的硼酸缓冲液，封闭反应1 h；11 000 r/min离心5 min去除上清液，使用1 mL标记抗体微球稀释液超声重悬微球，4 ℃储存。

1.4测试卡的设计及组装 使用激光切割机分别将PMMA切割成上盖和底板，将3M双面胶切割成通道结构。上盖使用等离子表面活化后，使用pH值为2.00硫酸溶液浸泡处理后，烘干备用；底板使用等离子表面活化后，APTES溶液浸泡10 min，N2吹干后浸泡于戊二醛溶液中10 min，N2吹干后分别在指定区域固定捕获抗体及标记微球，按步骤组装成微流体测试卡。

1.5免疫反应流程 检测时，直接向加样区滴加80 μL血清，固定在通道中的标记微球首先与标本中待测抗原反应形成抗原-标记微球复合物；在标本流经捕获抗体固定区时，抗原-标记抗体复合物与固定在检测区的捕获抗体反应，形成捕获抗体-抗原-标记微球复合物；检测区微球的捕获量与标本中抗原浓度相关。在激发波长340 nm、发射波长615 nm、延迟时间600 μs条件下使用多模式微孔板分析仪测定检测区荧光强度，从而实现对标本中待测抗原的定量。整个检测过程能够在10 min以内完成。见图1。

1.6统计学处理 构建标准曲线时，每个标准点测量3次，建立与标准浓度之间的参考曲线，使用origin进行线性拟合并计算相关系数。进行方法学比较时，每个实际血清样本测试1次，并将测试结果与商业化平台测试结果进行比对，使用origin进行线性关系对照，并计算两者之间的线性相关系数。

2 结 果

2.1捕获抗体点样浓度优化 分别使用不同浓度的捕获抗体进行点样，测定不同cTnT和H-FABP浓度的标本，考察捕获抗体点样浓度对免疫反应的影响。对于2种抗原的检测，当捕获抗体的点样浓度达到50 μg/mL时，检测的荧光信号值均不再随点样抗体浓度的增加而增加。在测试卡制作时，针对2种标记物的检测捕获抗体点样浓度均确立为50 μg/mL。见图2。

图1 免疫分析反应流程图

注：A为不同捕获抗体浓度检测cTnT；B为不同捕获抗体浓度检测H-FABP。

2.2标记抗体使用量优化 分别使用不同体积标记微球固定在通道内，测定不同cTnT和H-FABP浓度的标本，考察标记抗体使用量对免疫反应的影响。当标记微球使用量达到1 μL时，检测的荧光信号值达到饱和值。在后续实验中，针对2种标志物检测标记微球使用量均选择1 μL。见图3。

2.3标准曲线 在设定好的检测条件下，建立cTnT在0.1～100.0 ng/mL范围的标准工作曲线(n=3)，标准曲线的相关系数>0.99，检出限为0.02 ng/mL(s/n=3)；建立H-FABP在0.5～100.0 ng/mL范围的标准工作曲线(n=3)，标准曲线的相关系数>0.99,检出限为0.05 ng/mL(s/n=3)。针对2个指标检测的线性关系均良好，可以满足临床标本的定量检测的需求。

2.4稳定性 考察了组装好的测试卡在37 ℃放置一定时间后的检测性能，其中cTnT和H-FABP的浓度均为10 ng/mL。在37 ℃放置7 d后，测试卡对2种标志物的检测均能保持良好的检测性能，说明测试卡的稳定性良好。见图4。

注：A为不同标记抗体量检测cTnT；B为不同标记抗体量检测H-FABP。

2.5特异性 考察了cTnT和H-FABP的浓度均为10 ng/mL时，在待测标本中分别加入1、10 μg/mL的C-反应蛋白、50 ng/mL的降钙素原，测试不同浓度、不同类别干扰物对检测结果的影响，结果显示干扰物的加入对2种抗原的检测没有影响，说明该测试卡对2种标志物的检测特异性良好。见图4。

注：A为测试卡稳定性；B为测试卡特异性。

2.6血清测试方法学比较 利用建立起的微流体荧光免疫测试卡，检测了31份cTnT的临床血清标本，将这些标本的检测结果与罗氏公司的cobas®e411电化学发光全自动免疫分析仪的测试结果进行比较。R2=0.981 4，说明两者测试结果一致，系统之间相关性良好；利用建立起的微流体荧光免疫测试卡，检测了33份H-FABP的临床血清标本，将这些标本的检测结果与酶标试剂盒的测试结果进行比较。R2=0.957 5，说明两者测试结果一致，系统之间相关性良好。

2.7联合检测性能评估 使用添加法配制cTnT和H-FABP的混合血样，利用测试卡进行了人血清中2种靶标的联合检测。测试卡对2种标志物进行联合检测时，平均回收率>90%，批内精密度<15%，说明该方法有良好的检测效果，能够满足临床上的检测需求。见表1。

表1 2种标志物联合检测性能评估(n=4)

3 讨 论

临床上，几种生物学标志物的联合检测能够极大地提高诊断的稳定性及特异性，多靶标同时检测可减少标本的使用量，减轻患者的痛苦；传统的免疫比浊法、酶联免疫吸附测定、免疫侧向的方法难以满足多靶标同时检测的要求。微流体技术与免疫测定技术相结合，使用时间分辨荧光的方式进行标记，能够综合几种方法的优势，极大地降低荧光检测中背景荧光的干扰，提高检测的稳定性和特异性。

本研究建立了一种能够实现心脏疾病标志物cTnT和H-FABP联合检测的微流体测试卡，为了使测试卡的性能达到最佳，本研究分别对捕获抗体点样浓度和标记抗体使用量进行了优化，结果表明，捕获抗体点样浓度达到50 μg/mL时，免疫反应达到饱和；标记微球使用量1 μL时，免疫反应达到饱和；加急反应显示测试卡在37 ℃放置7 d仍能保持较高的反应性。在设定好的反应条件下，该测试卡在10 min内即可实现2种心脏疾病标志物的联合检测，cTnT在0.1～100.0 ng/mL范围内有良好的线性关系，检出限为0.02 ng/mL；H-FABP在0.5～100.0 ng/mL范围内有良好的线性关系，检出限为0.05 ng/mL。针对于2种标志物的检测，该方法回收率为94.0%～109.5%，批内精密度均<15%，呈现出良好的精密度和重现性。同时，进行血清检测时，与商业化的检测方法比较，相关系数均>0.95，测试结果一致，相关性良好。

该测试卡可以应用于肿瘤、过敏原等其他标志物的检测，与电化学等传感器平台集成，能够实现更广泛的应用，从而更适用于临床的快速检测。

综上所述，本研究建立了微流体测试卡对心脏疾病标记物cTnT和H-FABP的联合检测方法，与临床上使用的商业化仪器和方法比较一致性良好；使用添加法进行了cTnT和H-FABP的联合检测，回收率、精密度均能满足临床要求，说明该检测方法能够应用于心脏疾病标志物的检测。同时，该检测方法检测成本低、制作方法简单、操作简便、能够在10 min内完成相关标志物的检测，检测特异性和检测范围均能满足临床检测的需求。