Ag掺杂HA粉体及陶瓷材料的制备和抗菌性能研究

李晓爽，于景媛，李 强

Ag掺杂HA粉体及陶瓷材料的制备和抗菌性能研究

李晓爽，于景媛，李 强

（辽宁工业大学 材料科学与工程学院，辽宁 锦州 121001）

利用水热法合成载银羟基磷灰石抗菌粉体，并通过高温烧结法制备载银羟基磷灰石陶瓷材料。以大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌为研究对象，通过测量抑菌圈、最小抑菌浓度(MIC)和杀菌率的方法来测定载银羟基磷灰石粉体和陶瓷材料的抗菌性能。研究结果表明Ag+取代Ca2+在HA晶体中的位置，生成AgCa10-x(PO4)6(OH)2，使衍射峰发生了偏移。抗菌性实验表明随着Ag+掺入量的增加，抑菌圈直径增大但是抗菌剂最小抑菌浓度降低，杀菌率结果表明载银羟基磷灰石粉体和烧结后陶瓷块体对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有良好的抗菌性且具有一定的抗菌持久性，其中载银羟基磷灰石块体材料的抗菌效果更佳。

纳米载银羟基磷灰石粉体；载银羟基磷灰石陶瓷；水热法；抗菌性

HA材料由于具有与人体硬组织（如骨骼、牙齿等）的无机成分相似的结构和组成，以及良好的生物相容性、生物活性而被广泛应用于医学领域，如骨填充材料或非受力部位的植入体等[1-2]，但是羟基磷灰石容易吸附蛋白质、氨基酸和其他有机质，这导致细菌容易在HA植入物材料表面滋生[3-4]。研究表明在由生物材料引发的感染中，45%是细菌黏附在材料表面从而破坏材料结构造成的[5]。为解决这一问题，常在材料中引入抗生素，但抗生素易被体液迅速冲洗而不能长期保护材料，而且微生物在抗生素长期作用下可能因基因突变产生耐药性[6]。Ag＋对细菌、真菌和病毒都具有良好的广谱抗菌能力[7]。研究表明虽然Ag+对微生物的毒性强，但对人体细胞相对安全。近些年，载银羟基磷灰石抗菌粉体（Ag-HA）逐渐成为抗菌材料的研究热点。本工作结合了Ag＋的广谱、高效抗菌性及HA的生物活性、相容性两者的优点，采用水热法一步合成Ag-HA粉体，并通过高温烧结制备Ag-HA陶瓷材料，这种抗菌材料具有安全性高，不易挥发，不易分解，耐热性好，对人体无害且能长效抗菌、防霉等特点，是一种具有环保性质的功能性新材料。本文通过XRD和SEM等手段对粉体进行表征。以大肠杆菌和金黄葡萄球菌为研究对象，通过测量抑菌圈、最小抑菌浓度(MIC)和杀菌率的方法来测定Ag-HA粉体以及陶瓷的抗菌性能。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

硝酸钙（Ca(NO3)2）、硝酸银（AgNO3）、磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)、十二烷基苯磺酸钠、氨水(NH3·H2O)、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠(NaCl)、琼脂粉、大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。

1.2 水热法合成Ag-HA粉体

配置浓度为0.167 mol/L的AgNO3、Ca(NO3)2·4H2O溶液和浓度为0.1 mol/L的(NH4)2HPO4溶液。按照实验设计量将不同体积的AgNO3溶液加入到Ca(NO3)2溶液中，使得载Ag量分别为0.5 mol%（0.5 Ag-HA）、1.0 mol%（1.0 Ag-HA）和2 mol%Ag（2.0 Ag-HA），然后加入0.1 g十二烷基苯磺酸钠，磁力搅拌15 min后再滴入0.1 mol/L的(NH4)2HPO4溶液搅拌30 min后，加入氨水调节混合溶液pH=10~11。将混合液装入反应釜中，放入烘箱内180 ℃下保温6 h，进行水热反应。待其冷却至室温后静置24 h后将溶液离心，并用乙醇和离子水进行多次洗涤，然后在80 ℃下干燥6 h，制备载Ag量不同的Ag-HA粉体。

1.3 Ag-HA陶瓷烧结

将载Ag-HA粉体在80 MPa下压制成型，样品尺寸为15 mm×4 mm，生坯室温干燥24 h后，在管式炉中烧结成型，烧结温度为1 150 ℃，升温速率3 ℃ /min，保温时间2 h，随炉冷却至室温。

1.4 抑菌圈测试

将无菌的固体培养基加热后倒入装有200 μL的细菌培养皿中，等待培养基凝固。将牛津杯均匀分布在凝固的培养皿上，用移液枪取150 μL不同载银量的 Ag-HA悬浊液放入牛津杯中，盖上陶土盖放入37 ℃生化培养箱中培养24 h，同理将不同载银量的 Ag-HA块体均匀分布在凝固的培养皿上，也放入37 ℃生化培养箱中培养24 h，用游标卡尺测量牛津杯和圆块周围的抑菌圈直径。

1.5 最小抑菌浓度测试

将不同载银量的Ag-HA粉体制成浓度为4 800 μg/mL的悬浊液，将试管中的悬浊液用2倍稀释法将浓度依次稀释并获得浓度为4 800、2 400、1 200、600、300、150、75、37.5、18.75 μg/mL的抗菌悬浊液，一组不加抗菌剂作为空白对照，向每个试管中加入100 μL浓度为105 cfu/mL的菌液，放入37 ℃生化培养箱中培养24 h后，在每个试管中分别移取100 μL悬浊液涂平板，倒置平板培养24 h后观察结果，确定最小抑菌浓度。

1.6 杀菌率测试

向装有10 mL的液体培养基试管中放入100 μL浓度为105 cfu/mL的菌液，将不同载银量的 Ag-HA粉体放入浓度为105 cfu/mL菌悬液中，使其均匀分布在菌悬液中。分别在1、5、9、18 h和24 h以后移取100 μL菌液进行10倍的稀释涂平板，将平板倒置培养24 h观察平板上的细菌数目得出杀菌率，块体同上。杀菌率计算公式为：

式中：为杀菌率，为对照组细菌数，为实验组细菌数。

2 实验结果与分析

2.1 Ag掺杂纳米HA粉体的物相组成分析

图1是180 ℃下合成的不同载Ag量的纳米HA粉体的XRD图谱。表1为不同载Ag量的纳米HA粉体在（002）晶面的XRD参数分析。从图1和表1中可知，在180 ℃下水热合成的不同载Ag量的纳米HA粉体有尖锐的衍射峰且有相同的峰形。说明水热合成的Ag-HA晶体具有良好的发育和较高的结晶程度。在XRD图中未检测到新相，这说明所制备的粉体主要由HA相组成。与纯HA衍射峰25.992°比较，所有Ag-HA的晶面衍射峰位向小角度方向偏移，其原因可能是由于Ag+半径大于Ca2+半径，Ag+掺杂后引起HA晶格畸变，导致面间距变小，根据布拉格方程=2sin，当X射线的波长不变的时候，变大则会变小，从而造成了衍射角向小角度偏移。因此Ag掺杂HA粉体后，Ag+将HA晶体中Ca2+的位置替代生成了Ca10-xAg(PO4)6(OH)2离子固溶体。

图1 不同载银量Ag-HA粉体的XRD图谱

表1 不同Ag掺杂的HA粉体的XRD参数分析

2.2 Ag掺杂纳米HA粉体的微观形貌分析

图2是不同Ag掺杂HA粉体的微观形貌照片。在图2中可以看到水热法180 ℃时，Ag-HA结晶度高，长度在200~300 nm，直径在20~40 nm，有较高长径比。在Ag原子分数为2%，长径比最为明显。分析其原因如下：HA 在结晶结构上存在平行于c轴的通道，在HA中引入Ag+后，Ag+沿c轴进入晶胞取代Ca2+位置, 由于Ag+（0.115 nm）半径比 Ca2+（0.106 nm）半径略大，前者和后者可以完成1∶1的替代，由于二者价态上的差异，所以结构中存在未饱和的电场力，导致晶体生长变形。当 Ag+取代 Ca2+时，沿 c轴方向的微晶尺寸的增加幅度较大，而沿 a 轴方向的微晶尺寸基本不变；故当Ag掺入量增大时，HA晶体是沿晶轴方向生长的，细棒状晶粒的长度增加。

图2(e)是2%Ag-HA粉体的EDS分析谱图。在图2(e)中可以看到Ag元素的峰值，这说明Ag确实掺杂进HA粉体中。（其中Na和Si元素来源于分散HA粉体时水溶液的污染）。由EDS分析计算出Ca和P的百分含量，其中Ca/P比等于1.63，而纯HA中Ca/P比等于1.67，这说明部分Ca2+离子的含量被Ag+离子所取代。

(a)HA；(b)0.5% Ag-HA；(c)1% Ag-HA；(d)2% Ag-HA；(e)2% Ag-HA粉体的EDS分析谱图

2.3 Ag-HA粉体的抗菌性能分析

图3中1组和2组分别为不同载Ag量Ag-HA粉体在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中培养24 h效果图，表2表示了不同载Ag量Ag-HA粉体的大肠杆菌/金黄色葡萄球菌抑菌圈直径(mm)。

(a) HA; (b)0.5% Ag-HA; (c)1% Ag-HA; (d)2% Ag-HA

表2 不同载银量Ag-HA的大肠杆菌/金黄色葡萄球菌抑菌圈直径 (mm)

由图3和表2可知，纯HA牛津杯周围长满了细菌，说明纯HA对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌基本无抑菌作用，随着银离子的掺入，牛津杯周围没有菌落生长，开始出现明显的抑菌圈，随着载银量的增加，抑菌圈直径也随之增加，因此载银HA对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑制效果。此外，又培养3 d，抑菌圈直径无明显变化，牛津杯周围没有细菌生长，这表明Ag-HA具有一定的抗菌稳定性。

为了进一步考察不同载银量的HA粉体的抗菌效果，测定了不同载银量HA粉体的最小抑菌浓度（MIC值）。图4是0.5% Ag-HA粉体对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度图。由图4可知，当添加Ag-HA悬浊液浓度为4 800 μg/mL至150 μg/mL时，培养皿中并无细菌生长，细菌全部被Ag+杀掉，当浓度为 75 μg/mL时，培养皿中开始出现少量细菌，大部分细菌被Ag+杀掉，随着Ag-HA悬浊液浓度逐渐降低，培养皿中细菌的数量开始不断增多，(j)为本实验的空白对照组，未加Ag-HA悬浊液，因此培养皿中长满了细菌。所以0.5% Ag-HA的最小抑菌浓度为150 μg/mL。实验测得0.5%、1%、2% Ag-HA对大肠杆菌的最小抑菌浓度依次为300、150、75 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度依次为150、75、37.5 μg/mL，数值都低于800 μg/mL，且随着载银量的增加，最小抑菌浓度值逐渐降低。

(a)4 800 μg/mL; (b)2 400 μg/mL; (c)1 200 μg/mL; (d)600 μg/mL; (e)300 μg/mL; (f)150 μg/mL; (g)75 μg/mL; (h)37.5 μg/mL; (i)18.75 μg/mL; (j)空白对照

图5中1组和2组分别是0.5% Ag-HA、HA粉体在大肠杆菌中培养不同时间的杀菌率。图6中1组和2组分别是0.5% Ag-HA、HA在金黄色葡萄球菌中培养不同时间的杀菌率。

由图5、6可知，0.5%Ag-HA粉体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的杀菌作用。0.5% Ag-HA粉体在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中培养1h时杀菌率就可达到99.9%、98%。作用5 h后，可以看到培养皿中完全没有细菌生成，对两种细菌的杀菌率可达到100%。而纯HA在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中作用1 h时，细菌便长满了整个培养皿，所以其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌几乎无抗菌作用。1% Ag-HA和2% Ag-HA对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在1 h的杀菌率就可达到100%，说明抗菌剂载银量越大，其杀菌效果越好。

(a)1 h; (b)5 h; (c)9 h; (d)18 h; (e)24 h;

(a)1 h; (b)5 h; (c)9 h; (d)18 h; (e)24 h

图7为Ag-HA粉体的抗菌模型，其抗菌原理可能是因为：大肠杆菌的细胞壁主要是由肽聚糖和脂多糖组成，Ag+可能通过阻碍聚糖链、短肽，肽桥的形成，使肽聚糖不能正常合成，破坏了细胞壁，使细菌生长受阻。此外，Ag+穿过细胞壁，与细胞膜蛋白质结合，细胞膜蛋白质主要是以内在蛋白和外在蛋白两种形式同膜脂质相结合的，Ag+能够与内在蛋白中的疏水羟基结合使细胞膜蛋白质受损，破坏了细胞内环境的稳定性和生化反应的有序进行。同时Ag+与细胞内部蛋白酶的巯基结合，使蛋白酶失去活性，使细菌细胞致死。同时也会干扰DNA分子的复制，阻碍细菌繁殖。

图7 Ag-HA抗菌模型

2.4 Ag-HA陶瓷材料的抗菌性能分析

图8是纯HA、1% Ag-HA、2% Ag-HA块体在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中培养24 h效果图，表3是其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌圈直径（mm）。由图8和表3可知，纯HA圆块周围长满了细菌，基本无抑菌效果。1% Ag-HA、2% Ag-HA块体周围细菌被杀死出现明显的抑菌圈。1% Ag-HA、2% Ag-HA块体对大肠杆菌的抑菌圈直径分别为15.9 mm和18.5 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为16.2 mm和19.1 mm，均大于同载Ag量的Ag-HA粉体对两种细菌的抑菌圈直径。这说明相对于Ag-HA粉体，Ag-HA块体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果更好。这可能是因为Ag-HA粉体所制备的悬浮液中释放出的Ag+离子浓度相对于Ag-HA块体释放出的Ag+离子浓度小，而Ag+离子浓度越大，抑菌效果越好，所以本实验中块体Ag-HA材料比粉体的抑菌效果更好。

(A1) HA; (B1)1% Ag-HA; (C1)2% Ag-HA(A2) HA; (B2)1% Ag-HA; (C2)2% Ag-HA

表3 不同载银量Ag-HA块体的大肠杆菌/金黄色葡萄球菌抑菌圈直径 (mm)

(a)HA; (b) 1% Ag-HA

图9是HA、1% Ag-HA圆块在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中培养1h的杀菌率图。由图可知，纯HA圆块在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中作用1 h时，整个培养皿中长满了细菌，所以纯HA圆块对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌并无明显的杀菌作用。1% Ag-HA圆块在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中培养1 h时杀菌率就可达到100%。作用5、9、18、24 h后，培养皿中仍没有长出细菌，杀菌率依然为100%。2% Ag-HA圆块在两种细菌中作用1、5、9、18、24 h后杀菌率可达到100%。因此Ag-HA圆块对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有良好的杀菌效果。

3 结论

（1）XRD分析表明Ag+的掺杂使HA的（002）衍射峰向小角度进行了偏移，这说明Ag+的掺杂部分取代了HA中Ca2+的位置。SEM观察表明Ag+掺杂的HA粉体呈现细棒状，在Ag含量为2 at%，长径比最为明显。

（2）抗菌性实验表明：在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养液中，随Ag+掺入量的增加，Ag-HA粉体抑菌圈直径增大，在2% Ag-HA时抑菌圈直径分别达到最大值18.5 mm和19.1 mm，最小抑菌浓度逐渐降低到37.5 μg/mL。Ag-HA块体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径比粉体大。

（3）Ag-HA粉体和块体对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有良好的杀菌作用和抗菌持久性，杀菌率可达到100%。纯HA粉体和块体对细菌的生长几乎无抑制作用。

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Study on Preparation and Antibacterial Properties of Silver-loaded Lydroxyapatite Powder and Silver-Loaded Hydroxyapatite Ceramic

LI Xiao-shuang, YU Jing-yuan, LI Qiang

（School of Materials Science and Engineering, Liaoning University of Technology, Jinzhou 121001, China）

Silver-loaded hydroxyapatite antibacterial powder (Ag-HA) was synthesized by Hydrothermal method. The E.coli and Staphylococcus aureus were used as the research objects, and the antibacterial properties of the silver-loaded hydroxyapatite antibacterial agents were determined by the inhibition zone and the minimum inhibitory concentration (MIC) and bactericidal rate. The results show that Ag+substitutes for the position of Ca2+in the HA crystal produce AgCa10-x(PO4)6(OH)2in hydrothermal conditions, and the XRD peaks shift. The antiseptic experimental results show that the diameter of the inhibition zone increases and the MIC of the antibacterial agent decreases with the increase of the Ag+contents for the Ag-HA powder and Ag-HA ceramic samples. The results of the sterilization rate show that Ag-HA powder and ceramic samples have a good effect on the E.coli and Staphylococcus aureus and certain antibacterial persistence. The antibacterial activity of Ag-HA ceramic was better than that of Ag-HA powder.

silver doped nano-hydroxyapatite powder; silver doped nano-hydroxyapatite ceramic; hydrothermal method; antibacterial property

TB34

A

1674-3261(2021)01-0038-05

10.15916/j.issn1674-3261.2021.01.009

2020-04-11

国家自然科学基金资助项目（51805236），辽宁省教育厅基础研究项目（JJL201915407）

李晓爽(1996-)，女，辽宁大连人，硕士生。

于景媛(1979-)，女，辽宁铁岭人，教授，博士。

责任编校：刘亚兵