lncRNASNHG14/miR-331-3p/CCR1 轴在急性肺损伤中的作用机制研究

朱金源，白吉佳，张小亚

(宁夏医科大学总医院重症医学科，宁夏 银川)

0 引言

急性肺损伤及其最严重的阶段急性呼吸窘迫综合征，是严重威胁患者生命的常见临床危重症，发病机制复杂，迄今尚未完全阐明，且病死率仍高达40%[1]。因此，探索急性肺损伤的发病机制及有效治疗措施颇有必要。LncRNA是一类新兴的大分子非编码 RNA，它与 miRNA 及其下游靶基因之间的相互调控作用同炎性疾病的发生密切相关。miRNA 作为一个转录后调控的重要因子，其活性可被lncRNA 通过“海绵”吸附的方式调控，此类 lncRNA 又被称为竞争性内源 RNA。lncRNA 作为竞争性内源 RNA 竞争性地与 miRNA 结合，从而调节编码基因的蛋白质水平，并参与调控细胞的生物学行为。lncRNA 可作为竞争性内源RNA 吸附 miRNA 调控肺上皮细胞凋亡，然而在急性肺损伤中发挥竞争性内源功能的 lncRNA 目前仍知之甚少，因此，我们希望能进一步探究竞争性内源机制在急性肺损伤中的作用。

lncRNA SNHG14 在脂多糖诱导的小鼠肺泡巨噬细胞中高表达，且作为竞争性内源RNA 与miR-34c-3p 和WISP1具有靶向调控关系，下调SNHG14 可通过miR-34c-3p 介导WISP1，从而缓解脂多糖诱导的急性肺损伤，说明SNHG14/miR-34c-3p/WISP1 轴在急性肺损伤的发生发展中起到一定的作用[2]。我们预实验结果表明：脂多糖诱导后小鼠肺泡巨噬细胞和小鼠肺组织中miR-331-3p 表达降低，说明miR-331-3p 可能也参与了急性肺损伤的进程，但具体机制尚不明确。因此，我们猜测SNHG14 可能通过作为竞争性内源吸附miR-331-3p，进而促进急性肺损伤的发生。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健 康 雄 性SPF 级C57/BL6 小 鼠54 只，6～8 周 龄，体 质量(20±2)g，购于南京模式动物所。实验开始前7d 饲养于宁夏医科大学总医院动物实验室，室温(24±1)℃，相对湿度40%～80%，给予正常饮食，自由饮水。

1.1.2 主要试剂和仪器

MH-S 细胞购自美国ATCC 公司，LPS 购自上海劲马生物科技有限公司，LightCycler 480II 实时荧光定量PCR 仪(瑞典Roche 公司)。

1.2 方法

1.2.1 miR-331-3p 的筛选以及与CCR1 靶向关系研究

(1)体外实验ALI 细胞模型的建立和细胞转染

体外培养小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)，按照常规方法进行细胞培养换液，调整细胞浓度为4×105 个/mL，每孔100μL接种于96 孔培养板中培养1h。对照组加入12K 培养基，除空白对照组外其余各组加入终浓度为100μg/mL 的LPS，培养18h，构建ALI 细胞模型。根据细胞生长速度调整密度并铺6 孔板，使细胞在第二日转染时密度达80%-90%，使用lipofectmine2000(Invitrogen)试剂盒进行转染。

(2)荧光定量PCR 方法检测急性肺损伤细胞模型中miR-331-3p 的表达水平

通过生物信息学筛选CCR1 上游miR-331-3p，检测ALI细胞模型中miR-331-3p 的表达水平。按Trizol 方法说明书操作提取总RNA，设计miR-331-3p 和CCR1 引物，由Takara公司合成。使用PrimeScriptRT 试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，设定反应条件为：37℃，15min×3 次(逆转录反应)，85℃5s(逆转录酶失活反应)。取反应液进行荧光定量PCR，参照SYBR®PremixExTaqTMII 试剂盒(RR820A，TaKaRa)说明书进行PCR 操作。

(3)Elisa 检测各组炎症因子的表达水平

调整细胞浓度为4×105 个/mL，每孔500μL 接种于24孔培养板中培养1h，加入终浓度为100μg/mL 的LPS，继续培养24h。收集各孔细胞培养液于离心管中，1500r/min 离心10min，取上清液，按照细胞因子ELISA 检测试剂盒的程序操作，检测CRP、PCT、IL-1、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表达。

1.2.2 SNHG14 吸附miR-331-3p 调控CCR1 的表达，参与ALI 进程

使用生物信息学软件预测SNHG14 与miR-331-3p 的结合位点，采用双荧光素酶试剂盒验证SNHG14 与miR-331-3p 的靶向关系。用Promega 公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System 检测荧光强度。

1.2.3 体内实验验证SNHG14 调控CCR1 的表达，参与ALI 进程

SPF 级雌性C57BL/6 小鼠54 只，8～10 周龄，随机分为Model 组( 鼻 内 滴 注LPS，1mg 溶 于5mL，N=120) 和Control组(鼻内滴注等体积生理盐水，N=15)。qRT-PCR 检测各组SNHG14、miR-331-3p 和CCR1 的表达情况。

图1 SNHG14 可能通过吸附miR-331-3p 调控CCR1 的表达

比较小鼠肺组织病理特征、肺水肿程度及肺损伤评分，并测定肺微血管通透性变化。

①HE 染色及Smith 肺损伤评分：取小鼠肺组织，10%甲醛溶液固定，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，切片5μm 厚。二甲苯脱蜡，乙醇复水，苏木素染色7min，自来水冲洗，95%乙醇5s，伊红染色1min。梯度乙醇水化，二甲苯透明，晾干，中性树胶封片后显微镜下观察组织病理学变化。同时行肺组织Smith 评分，评价肺损伤的严重程度。②肺湿干重比(W/D)和肺水含量测定：收集小鼠右肺下叶，测定“湿”重。然后80℃干燥肺组织，48h 后测定“干”重，肺W/D=湿重/干重。同时，根据公式计算肺水含量，肺水含量=[(湿质量一干质量)/湿质量]×100%。③比色法测定肺微血管内皮通透性变化：小鼠尾静脉注射伊文思蓝50mg/kg，将小鼠开胸取肺脏0.1-0.3g，将肺浸泡在甲酰胺溶液中，置于37℃孵育72h，将组织中色素全部浸出，取出组织，离心后取上清液，用分光光度计在620nm 波长处进行比色，根据标准曲线计算伊文思蓝含量，评价肺微血管内皮通透性变化。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，各组标准化的样本数值用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用非参数的秩和检验，两组之间比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG14 可能通过吸附miR-331-3p 调控CCR1 的表达

RNA22 数 据 库 分 析miR-331-3p 与SNHG14、CCR1 分别存在结合位点，通过双荧光素酶验证，与NC mimic 相比，miR-331-3pmimic 与wt-SNHG14 共转染导致荧光强度显著降低(P＜0.05)，miR-331-3p mimic 与SNHG14 被证实有靶向关系。另外，双荧光素酶报告实验证实，如图1C 所示，与NC mimic 相比，miR-331-3pmimic 与wt-CCR1 共转染导致荧光强度显著降低(P＜0.05)，miR-331-3p 与CCR1 被证实有靶向关系。qRT-PCR 检测LPS 诱导下的MH-S 细胞和小鼠肺组织中miR-331-3p 明显低表达(P＜0.05)。

2.2 SNHG14 与miR-331-3p 表达呈负相关

对miR-331-3p 与SNHG14 进行相关性分析，发现miR-331-3p 表达随着SNHG14 表达升高而降低，并且与NC-ASO相比，SNHG14-ASO 中miR-331-3p 表达明显升高，但是mut-SNHG14 组中miR-331-3p 表达无显著变化，miR-331-3p 与SNHG1 呈现负相关。

3 讨论

脓毒症是宿主对感染反应失调引起的致命性器官功能障碍，而肺脏是脓毒症时最易累及的器官，由脓毒症引发的急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征是脓毒症患者死亡的主要原因[3]。研究表明，脂多糖是革兰阴性菌致脓毒症的主要抗原物质，因而通过脂多糖诱导成为模拟急性肺损伤的经典方式[2,4]。我们前期通过荧光定量PCR 检测脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞和小鼠肺组织中lncRNA 表达情况，结果显示SNHG14 高表达，因此，我们猜想 SNHG14 在急性肺损伤中可能发挥作用。SNHG14 在胶质瘤中，通过作为“海绵分子”抑制细胞增殖和侵袭，并促进细胞凋亡。敲除SNHG14 基因可抑制缺血性中风后释放的炎症细胞因子，从而对脑梗塞起保护作用，但目前尚缺乏SNHG14 在急性肺损伤中的研究[5]。本研究采用急性肺损伤经典造模术式，通过气管内滴注脂多糖构建急性肺损伤小鼠模型，苏木精和伊红染色观察肺组织病理学改变，同时，体外培养小鼠肺泡巨噬细胞，并给予终浓度为 100 μg/mL 的脂多糖刺激，培养 18 h，成功构建急性肺损伤细胞模型。

研究发现 miR-331-3p 在急性肺损伤中表达下调，认为miR-331-3p 可能是预测急性肺损伤的生物标志物。为了进一步明确miR-331-3p 在急性肺损伤中的作用机制，我们通过RNA22 数据库及双荧光素酶证实：miR-331-3p 与CCR1具有结合位点。趋化因子与各种炎症反应相关，参与中性粒细胞的转运、募集和再循环。在急性肺损伤中，趋化因子可通过增强趋化因子受体(CCR)的表达，使中性粒细胞募集至肺脏，参与了肺脏的炎症反应[6]。在流感病毒和博莱霉素所致肺损伤模型中，CCR2 基因敲除鼠肺损伤程度明显减轻；而CCR1 的拮抗剂可保护脓毒血症所致肺损伤。然而对脂多糖所致肺损伤中CCRs 的调节作用却鲜有报道[7]。我们前期通过生信分析预测SNHG14、miR-331-3p 和CCR1 具有结合位点，双荧光素酶实验证实它们之间具有靶向关系，且脂多糖诱导后MH-S 细胞和小鼠肺组织中miR-331-3p 表达降低，说明miR-331-3p 可能也参与了肺损伤的进程。

综上所述，SNHG14 可能同样作为ceRNA 吸附miR-331-3p，调控CCR1 的表达，从而参与急性肺损伤的进程。