穿心莲内酯联合氨苄青霉素对奈瑟球菌感染脑膜炎大鼠治疗作用的研究

吴 斐 刘新平

细菌性脑膜炎是一种中枢神经系统重度感染性疾病，以急性发热、惊厥、颅内压升高等为主要临床表现，儿童患者居多[1]。细菌性脑膜炎病死率仍高达20%，并且约30%存活者留有脑麻痹、癫痫、听力损伤、认知障碍等神经系统后遗症[2,3]。奈瑟球菌是细菌性脑膜炎常见致病菌之一，属革兰阴性菌，其被杀灭解体后，细胞壁中的脂多糖将释放入血而引发内毒素血症，破坏脑组织结构，是导致患者死亡的主要因素[4,5]。抗生素是临床治疗细菌性脑膜炎的首选方案，但抗生素并不能有效控制脂多糖水平的升高。单用抗生素治疗奈瑟球菌感染脑膜炎效果并不理想[6]。因此，在合理应用抗生素抗感染治疗的同时，寻找新的辅助治疗药物与治疗方案，对改善细菌性脑膜炎预后具有重要意义。氨苄青霉素(ampicillin，AMP)是临床治疗革兰阴性菌感染脑膜炎的一线用药。穿心莲内酯(andrographolide，AG)是中药穿心莲的主要活性成分，具有良好的抗炎活性和抗菌作用[7～9]。本研究探讨了AG联合AMP对奈瑟球菌感染脑膜炎的治疗作用及其机制，现将研究结果汇报如下。

材料与方法

1.材料：(1)药物与试剂：穿心莲内酯胶囊购自丽珠集团利民制药厂(批号：190527)；注射用氨苄西林钠购自齐鲁制药有限公司(批号：6130104BF)；脂多糖(货号：H255，批号：20190612)、TNF-α(货号：H052，批号：20190531)、IL-1β(货号：H002，批号：20190507)、IL-6(货号：H007，批号：20190416)试剂盒(ELISA法)购自南京建成生物工程研究所；p65(货号：K200045M)、IκBα(货号：K000498P)、β-actin(货号：K200058M)一抗和IgG二抗(货号：SW1040)购自北京索莱宝科技有限公司。(2)实验动物：SPF级SD系雄性大鼠120只，2周龄，体质量80±5g，购自河北医科大学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(冀)2018-004；实验前适应性饲养3天(温度25±1℃、相对湿度60%±5%、光照黑暗各12h交替)。(3)奈瑟球菌株由笔者医院微生物室提供，于肉汤培养基中培养24h后(恒温37℃)，划线接种于固体培养基，取单菌落接种于肉汤培养基，取对数生长期菌体，0.9%NaCl注射液稀释为浓度1×108个/升的菌悬液，备用。

2.动物分组、造模与给药：将100只大鼠按照数字表法随机分为正常对照组、模型组、AG组(50mg/kg)、AMP组(200mg/kg)和联合组(AG 50mg/kg+AMP 200mg/kg)共5组[药物剂量：根据人和大鼠药物剂量换算公式，大鼠剂量为毫克/千克(mg/kg)=6.3Xmg/kg(X为人临床剂量)，按照成人体重65kg计算可得，AG大鼠剂量为29.08～65.42mg/kg，AMP大鼠剂量为193.85～387.69mg/kg；并参照蔡媛媛等[6]报道的大鼠实验剂量，确定本实验AG剂量为50mg/kg、AMP剂量为200mg/kg]，每组各20只。参照郦铮铮等[2]报道，采用小延髓池注射10μl奈瑟球菌悬液(浓度1×108个/升)的方法复制奈瑟球菌感染脑膜炎大鼠模型。造模后，AG组1次/12小时灌胃给药，AMP组1次/12小时皮下注射给药，联合组1次/12小时灌胃给予AG、皮下注射给予AMP，正常对照组和模型组灌胃给予0.9%NaCl注射液，共给药5次。本研究方案经笔者医院医学伦理学委员会批准，伦理批件号为HDZXLL[K]字2019-016。

3.各组大鼠存活率统计：分别于造模后第12、24、36、48、60h时统计各组大鼠存活率，60h时正常对照组存活20只、模型组存活0只、AG组存活12只、AMP组存活10只、联合组存活16只。因此，模型组于12h时行各指标检测(大鼠尚未死亡)，其余各组于60h时行各指标检测[6]。

4.症状评分及脑组织含水量检测：分别随机取正常对照组和模型组各10只、AG组6只、AMP组5只、联合组8只大鼠，参照刘成业等[10]报道的方法行症状评分：活动和行走未见异常计0分，活动和行走迟缓计1分，直立动作缓慢计2分，不能直立计3分。麻醉后脊椎脱臼处死，取脑组织称重为湿重(W1)，置105℃烤箱至恒重后称量为干重(W2)，含水量(%)=[(W1-W2)/W1]×100%。

5.血浆脂多糖和脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量检测：取各组剩余的大鼠，麻醉后经腹主动脉取血，按照ELISA试剂盒操作说明检测血浆脂多糖含量。脊椎脱臼处死后，取脑组织，去除小脑、脑干，加入9倍量4℃预冷裂解液、研磨匀浆，3000r/min离心15min后取上清液，按照ELISA试剂盒说明检测脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

6.脑组织p65、IκBα蛋白表达检测：取脑组织匀浆液，4℃、12000×g离心20min后取上清液，提取总蛋白，行凝胶电泳、转膜，5%脱脂牛奶37℃封闭1h后，滴加p65、IκBα、β-actin一抗后4℃过夜，洗膜后滴加二抗、室温孵育1h，洗膜后滴加ECL化学发光溶液显色，以β-actin为内参半定量p65、IκBα相对表达量。

结 果

1.各组大鼠存活率比较：正常对照组大鼠60h内全部存活，模型组大鼠24h内全部死亡；与模型组比较，AG组、AMP组、联合组存活率显著升高(P<0.01)；与AG组和AMP组比较，联合组存活率显著升高(P<0.01)，详见表1。

表1 各组大鼠存活率比较[n(%)]

2.各组大鼠症状评分及脑组织含水量比较：与正常对照组比较，模型组大鼠症状评分和脑组织含水量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，AG组、AMP组、联合组症状评分和含水量显著降低(P<0.05)；与AG组和AMP组比较，联合组症状评分和含水量显著降低(P<0.05)，详见表2。

表2 各组大鼠症状评分及脑组织含水量比较

3.各组大鼠血浆脂多糖和脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较：与正常对照组比较，模型组大鼠血浆脂多糖与脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，AG组、AMP组、联合组血浆脂多糖与脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著降低(P<0.01)；与AMP组比较，AG组和联合组血浆脂多糖和脑组织TNF-α、IL-6含量显著降低(P<0.05)，详见表3。

表3 各组大鼠血浆脂多糖和脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量

4.各组大鼠脑组织p65、IκBα蛋白表达比较：与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织p65表达显著上调而IκBα显著下调(P<0.01)；与模型组比较，AG组、AMP组、联合组p65表达显著下调且IκBα显著上调(P<0.01)；与AMP组比较，AG组和联合组p65表达显著下调且IκBα显著上调(P<0.05)，详见图1、表4。

图1 各组大鼠脑组织p65、IκBα蛋白表达A.正常对照组；B.模型组；C.AG组；D.AMP组；E.联合组

表4 各组大鼠脑组织p65、IκBα蛋白相对表达量

讨 论

细菌性脑膜炎具有多种致病菌，其中奈瑟球菌是最常见的革兰阴性病原菌之一，AMP是临床治疗革兰阴性菌感染脑膜炎的一线用药，而单用AMP治疗效果并不理想。因此，寻找新的辅助治疗药物与AMP联合应用或许是改善奈瑟球菌感染脑膜炎预后的有效途径。AG是中药穿心莲的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、提高免疫力等多种生物学活性[11～13]。

AG联合AMP治疗奈瑟球菌感染脑膜炎的文献报道尚不多见，本研究旨在探讨AG与AMP联合用药能否改善奈瑟球菌感染脑膜炎治疗效果以及提高存活率，并探索其相关机制。

本研究采用小延髓池注射奈瑟球菌悬液的方法制备脑膜炎大鼠模型，结果显示未给药干预的模型组大鼠于24h内全部死亡，该结果与杨新娟[14]的报道一致。单用AG或AMP治疗、AG联合AMP(联合组)治疗能够明显提高奈瑟球菌感染脑膜炎大鼠存活率，其中联合组存活率达80%，明显高于AG组的60%和AMP组的50%，并且联合组大鼠症状评分、脑组织含水量均明显低于AG组和AMP组；说明AG联合AMP对奈瑟球菌感染脑膜炎大鼠具有较好的治疗作用。

奈瑟球菌为革兰阴性菌，被抗菌药物杀灭导致其解体后，细胞壁中脂多糖将释放入血。脂多糖做为内毒素，由O-特异侧链、核心多糖、类脂A 3部分构成，其中类脂A能够与Toll样受体4结合，刺激单核细胞和巨噬细胞系统大量释放炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等，导致系列炎性反应，引发内毒素血症[15～18]。NF-κB以p50/p65二聚体形式存在，生理状态下与特异性酶抑制剂IκBα结合而无生理活性；IκBα磷酸化使p50/p65与IκBα解离并位移至细胞核，p65亚基与DNA特异性位点结合而诱导单核、巨噬细胞大量合成炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等，进而介导炎性反应[19, 20]。本研究发现，经AG或AMP单药治疗、AG联合AMP(联合组)能够明显降低奈瑟球菌感染脑膜炎大鼠血浆脂多糖和脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量，下调p65表达并上调IκBα表达，并且联合组和AG单药组对糖多糖、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及p65、IκBα表达的调控作用优于AMP单药组，说明AG联合AMP对奈瑟球菌感染脑膜炎大鼠的治疗作用可能与AG抑制内毒素血症和NF-κB炎性通路有关。

综上所述，AG联合AMP能够降低奈瑟球菌感染脑膜炎大鼠病死率，改善神经症状，抑制脑组织水肿，即AG联合AMP对奈瑟球菌感染脑膜炎大鼠具有良好的治疗作用，其机制可能与AG抑制内毒素血症和NF-κB炎性通路，进而抑制炎性反应有关。本研究结果显示，临床上应用抗生素治疗奈瑟球菌感染脑膜炎的同时，可以给予抗炎、抑制内毒素血症和缓解脑水肿的药物进行辅助治疗，或许能够提高治疗效果，改善患者预后。