微黄奈瑟菌引起急性尿路感染合并菌血症1例

蒋一飞，范坤，梅亚宁，刘成成(.宿州市第一人民医院检验科，安徽宿州34000；.南京医科大学第一附属医院检验学部，南京009)

奈瑟菌属(Neisseria)目前包括28个菌种，大部分属于人和动物黏膜正常菌群，其中约10余种可从人体分离[1]。除了淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌，其他大多数与人类相关的奈瑟菌均是上呼吸道正常菌群，可引起机会性感染，常见有浅黄奈瑟菌(Neisseriaflavescens)、微黄奈瑟菌(Neisseriasubflava)、灰色奈瑟菌(Neisseriasubflava)、长奈瑟菌(Neisseriaelongata)等。其中，微黄奈瑟菌引起的感染报道较少，可造成患者脑膜炎、菌血症等[2-4]。近来，宿州市第一人民医院诊治1例微黄奈瑟菌引起尿路感染合并菌血症患者，报道如下。

1 病历摘要

患者男，76岁，因“进行性排尿困难半年，加重2 d伴发热”于2019年7月14日入院。患者半年前无明显诱因出现排尿困难，表现为尿频、尿痛、排尿时间延长、夜尿增多。曾留置导尿治疗，近2日来排尿困难明显加重，伴有畏寒、发热，最高体温达40 ℃，遂就诊于宿州市第一人民医院泌尿外科。体格检查：T：38.6 ℃，BP：171/100 mmHg，R：21次/min，双肺呼吸音粗，未及干湿啰音；心率124次/min，律尚齐，心音可；腹平软，无压痛及反跳痛。前列腺约2度大，质韧，饱满，中央沟消失，未及硬结，无触痛。血常规：WBC 15.08×109/L，N 90.40%，血降钙素原(PCT)27.1 ng/mL；尿常规：尿白细胞酯酶1+，尿WBC 25个/μL，尿隐血2+，尿红细胞58个/μL。CT示：膀胱多发结石，左输尿管下端结石伴左侧肾盂输尿管扩张；前列腺肥大伴钙化。入院后采集血培养及中段尿培养均检出微黄奈瑟菌。就诊当日静脉输注头孢哌酮/舒巴坦联合左氧氟沙星经验性治疗并留置导尿管。治疗1周，患者发热症状消除，且尿液逐渐由浑浊变至澄清。而后，行左侧输尿管镜碎石取石术+经尿道膀胱碎石取石术，术后恢复良好，予以出院。

2 微生物学检查及结果

2.1细菌培养 患者入院后，随即送检血培养(需氧瓶和厌氧瓶各1瓶)和中段尿培养。血培养采用美国BD公司BactecTMFX400血培养仪进行，需氧瓶培养18 h报阳性，厌氧瓶培养5 d未报阳性。阳性瓶涂片革兰染色(珠海贝索公司)见革兰阴性双球菌，成对排列(图1A)。转种血琼脂平板和巧克力平板(郑州博赛公司)，置35 ℃、5% CO2培养24 h见直径1～2 mm、黄色、圆形、半透明、光滑、反光、边缘整齐、黏稠小菌落(图1B、C)，菌落涂片革兰染色同阳性瓶结果(图1D)。中段尿接种血琼脂平板和麦康凯平板，置35 ℃培养箱24 h，血琼脂平板可见细菌生长(菌落计数>105个/mL)，菌落形态及革兰染色结果同血培养结果，而麦康凯平板未见细菌生长。血培养和尿培养分离菌株分别命名为Strain B和Strain U。

2.2菌种鉴定

2.2.1生化鉴定 2株细菌触酶试验、氧化酶试验均阳性,氧化分解葡萄糖、麦芽糖、果糖，不分解乳糖、蔗糖。用法国生物梅里埃Vitek 2 Compact配套NH卡鉴定，结果均为干燥奈瑟菌(Neisseriasicca)，鉴定率和生物编码分别为93%和0637410010、98%和0633400000。质控菌株为啮蚀艾肯菌ATCC BAA-1152。

2.2.2质谱鉴定 用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)分析仪(法国生物梅里埃公司)鉴定，结果均为黄色/深黄/微黄奈瑟菌(Neisseriaflave/perflave/subflava)，置信度：99.9%。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 8739。

2.2.316S rRNA基因测序 用16S rRNA基因测序法，通用引物(27F/1492R)合成及双向基因测序由南京擎科生物公司完成。引物序列为：F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAGC-3′，R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。测序结果经BLAST比对，Strain B与参比菌株微黄奈瑟菌(NR_041989.1)、深黄奈瑟菌(NR_117694.1)、黏膜奈瑟菌(NR_117696.1)的同源性为前3位，依次为99.85%、99.20%和98.26%；Strain U的比对结果为：微黄奈瑟菌(NR_041989.1)99.78%、深黄奈瑟菌(NR_117694.1)99.13%、黏膜奈瑟菌(NR_117696.1)98.19%。

2.2.450 S核糖体蛋白L6片段基因(fragment of the 50 S ribosomal protein L6，rplF)测序rplF基因扩增及比对参考Bennett等[5]建立的方法。引物合成及基因双向测序由南京擎科生物公司完成。引物序列为：F：5′-CAGTGACTGTTCCCG

CTGGTGT-3′，R：5′-AGGYTCAGGAGKWCGGAAHG-3′。 测序结果显示，Strain B与Strain U的rplF基因序列相同。经PubMLST数据库(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_rmlst_seqdef_kiosk)比对，最佳匹配种属为微黄奈瑟菌[BACT000035(rplF)：823]。

2.3药敏试验 参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI) M45-A3卡他莫拉菌标准，选用M-H琼脂培养基，用E-test(郑州安图生物公司)和K-B法(英国Oxoid公司)检测菌株药物敏感性，结果见表1。用头孢硝噻吩法(法国生物梅里埃公司)检测β-内酰胺酶活性，结果均为阴性。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922与金黄色葡萄球菌ATCC 25923。

表1 2株细菌抗菌药物敏感性试验结果

3 讨论

本患者血液和尿液中分离的2株细菌最终鉴定为微黄奈瑟菌，且二者药敏结果相近，提示来源可能相同。Janda等[6]曾报道1名先天性尿道结构异常儿童患者，由于长期自行导尿发生微黄奈瑟菌引起的尿路感染。而本文报道该老年患者，不仅有泌尿道感染体征，还有菌血症等全身症状。结合该患者泌尿系统结石、前列腺增生、留置导尿管的病史，我们推测经泌尿道逆行感染的可能性大。

Vitek 2配套NH卡可提供部分奈瑟菌属细菌的鉴定能力，但其鉴定范围不包含微黄奈瑟菌，因此将其误鉴定为干燥奈瑟菌，但干燥奈瑟菌常见菌落形态与微黄奈瑟菌相比较差异较大。干燥奈瑟菌多为干燥、有皱纹、灰白色菌落，而微黄奈瑟菌属细菌多为光滑、产黄色素菌落。因此，随后将2株细菌行质谱鉴定，结果为黄色/深黄/微黄奈瑟菌。最近的基因组分析表明，微黄奈瑟菌应重新归为微黄奈瑟菌属的一个变种[7]。微黄奈瑟菌属即包括上述黄色奈瑟菌、深黄奈瑟菌、微黄奈瑟菌。16S rRNA序列分析是奈瑟菌属鉴定、分类的重要手段[8]。通过对2株细菌进行16S rRNA测序和核酸比对显示符合率最高的为微黄奈瑟菌。然而，最高的前2位菌种(微黄奈瑟菌、深黄奈瑟菌)间比对符合率差异未超过0.8%，所以用16S rRNA测序方法尚不能准确鉴定到种。rplF基因已被证明在奈瑟菌属鉴定中具有更高的分辨率[1]。rplF基因测序结果显示，2株细菌测序结果相同且经PubMLST数据库比对的最佳匹配菌种为微黄奈瑟菌。此外，糖类利用试验结果显示，分离菌株分解葡萄糖、麦芽糖、果糖，不分解乳糖、蔗糖，与黄红勋报道的结果一致[4]。而深黄奈瑟菌可分解蔗糖，所以可将深黄奈瑟菌排除。

目前CLSI尚无微黄奈瑟菌的药敏推荐方法。本文试探性地对几种临床常用药物进行敏感性试验。结果显示2株菌株的药敏数据差异均在1～2个梯度以内，其中氨苄西林、头孢哌酮/舒巴坦、头孢曲松、亚胺培南和美罗培南具有较低的最低抑菌浓度(MIC)。回顾本例患者的治疗，入院后经验性使用头孢哌酮/舒巴坦治疗后发热症状迅速缓解。虽然左氧氟沙星的MIC值高达8.0 μg/mL，但其在尿液中的药物浓度远大于血药浓度，仍可能会对尿路中微黄奈瑟菌有效。除外抗菌药物治疗，解除尿路梗阻并保持尿液引流通畅也是该病例治疗成功的关键。综合其他一些感染案例[3,9-10]，微黄奈瑟菌的机会致病性感染可能与年龄、免疫力低下以及侵袭性操作有关。由于实验条件限制，未使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)等分子生物学方法对2株细菌进行同源性分析。