酶联免疫吸附试验操作要点

陈华

（江苏省扬州市邗江区西湖镇畜牧兽医站，江苏 扬州 225200）

1 样品运输与保存

1.1 样品运输 ELISA（酶联免疫吸附试验）的样品一般为全血或血清。运输温度偏高、运输时间过长的血样会导致ELISA 灵敏度偏低，因此夏季血样应低温运输。

1.2 样品保存 如48h内能完成检测，血样只需2～8 ℃冷藏即可，如48 h 内无法完成检测，血样应于-20 ℃保存，长期保存血清可在-80 ℃，全血样品不适合冻存。血液样品含水量较大，冷冻固定时会对血样结构造成破坏，故超低温快速冷冻固定多适用于组织而非血样。

2 样品稀释

ELISA 一般要求对血样进稀释，不按要求稀释会出现非特异性反应，即假阳性。取出血样后，若发现胶冻样样品和溶血样品，应尽量弃去。研究表明重度溶血样品可能导致ELISA 出现假阳性。

稀释过程中影响实验结果的有两项：一是实验器材，微量移液器的精准度和吸头的质量会对实验结果造成较大影响，劣质的吸头会导致更多的样品挂壁残留，造成稀释倍数不准确；二是稀释方法，稀释样品应当混匀，稀释时应当避免取样过少，一般用10 μL稀释比用1 μL稀释更准确，更能避免样品挂壁影响。如果稀释倍数过大，可采用梯度稀释的方法稀释，如稀释40 倍，可以先进行4 倍稀释，再进行10 倍稀释，以保证稀释的精确度。

3 试剂盒平衡

实验前将试剂盒从2～8 ℃冷藏室取出置室温下，使试剂盒及板条恢复至室温（一般要求为20～25 ℃），平衡时间至少20 min。冬季室温偏低，平衡耗时加长，可将试剂盒置于暖风下或37 ℃温箱内。未平衡状态下进行实验会导致孵育不充分，影响样品与包被物的特异性反应。

4 加样方法

ELISA易出现污染的步骤就是加样。加样必须使用一次性的洁净吸头，每吸取一个样品都须更换吸头。

加样时应避免沿管壁加样，以免造成非特异性吸附，影响加样准确性；应当避免加样过快，以免造成液体溅出，出现交叉污染；应当避免产生气泡，特别是读取吸光值时，气泡会对最终结果产生影响。

正确的加样方法是匀速轻缓地将样品加于酶标板孔底，且加样时间不宜过长，否则会导致第一孔与最后一孔反应时间差异过大，影响实验结果。如果样品数量过多，加样时间过长，可使用排枪。

5 孵育方法

孵育是液相的抗原或抗体和酶标板反应孔内固相的抗原或抗体发生特异性反应的过程，这一步骤要求一定的反应温度和反应时间。常见的孵育温度为37 ℃和室温，一些ELISA 要求43 ℃、2～8 ℃和其他温度。如果孵育温度为37 ℃，则可使用温箱孵育，注意孵育前使温箱温度达到37 ℃，因为孵育所需时间与孵育温度成反比，所以未达到要求温度进行孵育会使抗原抗体反应不充分。

除此之外，孵育被证明会受到“边缘效应”的影响。用相同的样品在96孔板进行ELISA测定，会出现外周孔和中心孔吸光值不同的现象。这是由于酶标板材料——聚苯乙烯为不良导体，在从室温加热到37 ℃的过程中，外周孔和中心孔之间存在一定的热力学梯度，从而使酶标板的温度在刚放进温箱时并不均一。因此孵育前可用水浴或其他方法均匀加热，去除“边缘效应”的影响。为防止反应液的蒸发和污染，孵育过程中酶标板须贴上板贴。

6 洗板方法

6.1 洗涤液配制 洗板是ELISA 必不可少的步骤。在孵育过程中，除发生抗原抗体特异性结合反应外，还会出现非特异性吸附，因此，必须通过洗板将非特异性吸附物质洗去，避免实验结果出现假阳性。

洗板一般需要稀释洗涤液。稀释前注意观察浓缩洗涤液是否有结晶，如果有结晶则先让结晶在室温下全部溶解再进行稀释。稀释必须使用新鲜的蒸馏水，按说明书的稀释倍数进行稀释。

6.2 注意事项

6.2.1 加洗涤液时，冲击力不可过大，且洗涤液尽量不要溢出孔外，一般每孔加300 μL即可。

6.2.2 加入洗液后，需要静置1～3 min，以提高洗板的效率，避免非特异性物质残留。

6.2.3 两次洗涤之间和加入酶标抗体之前，应避免包被孔干燥。酶结合物不耐干燥，且高温下容易失活，包被孔干燥时间越长，最终得到的吸光值越低。

6.2.4 拍板时可在吸水纸下垫一层泡沫板，防止抗原抗体复合物脱离。拍板要垂直，避免交叉污染，每次拍板要尽量拍干。每次拍板后都要更换一次性吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸。吸水纸应选择不易脱屑且吸水性强的。

6.2.5 洗板次数一般为3～5次，次数低于3次易出现假阳性，高于5次易出现假阴性。

6.2.6 为避免人工洗板造成的不确定性，可采用自动洗板机洗板，使用洗板机要检查冲洗头是否顺畅。由于自动洗板机洗板后不能完全拍干，有较多液体残留，故可适当增加洗板次数或采用机洗和人工洗板相结合的办法减少误差，即机洗后人工洗板1～2次。

7 底物添加

目前ELISA 广泛使用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP），其一般以邻苯二胺（OPD）和3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）为底物。OPD 和TMB都有毒性和致突变性，操作过程中要注意防护。

加入底物前，要先检查底物的有效性，如果以TMB 为底物，一般会提供A、B 两瓶底物试剂，可各取少量相同体积的A、B 试剂于洁净的反应孔或试管内，观察是否出现显色反应，如果以OPD为底物，则应呈无色。在加入底物及之后的孵育过程中要注意避光，特别是OPD，这种底物在光照条件下会分解显色，影响结果的准确性。平常保存底物也应注意避光。

8 显色方法

显色最重要的是时间的把握，应按照ELISA说明书上标明的底物反应时间操作，到时间后立即加入终止液，终止液的加入顺序要和底物溶液的加入顺序相同。加入终止液后可观察到淡蓝色溶液变为黄色。

9 比色方法

加完终止液后立即进行比色，否则非特异性显色会随之增加。

比色可通过肉眼观察颜色梯度，但要精确得出结果还应使用酶标仪。测量前酶标仪应预热15～30 min，使光源稳定。不同的ELISA 试剂盒要求不同的滤镜，不同的波长。TMB底物的显色波长为450 nm，OPD的显色波长为492 nm。除使用单波长比色，也可使用双波长比色减小误差，即在敏感波长和非敏感波长各测一次，非敏感波长一般设为630 nm 或650 nm。由于实际测量的吸光值是溶液的吸光值、酶标板本身的吸光值及灰尘、指纹等污垢的吸光值之和，所以可用非敏感波长减少非样本的影响。