茭白叶黄酮类物质的提取工艺优化及抗氧化研究

何莉萍，张泽英，黄爱妮，李 丽，高 维

（武昌工学院城市建设学院，湖北武汉 430065）

茭白叶是我国第二大水生蔬菜茭白的叶，常被作为废弃物丢掉。茭白叶生物质量占茭白植株总质量的50%～70%，每667 m2茭白田每年产生的茭白鲜秸秆达5 000 kg 以上[1]。茭白产季，大量茭白叶腐烂在田间地头，造成资源的极大浪费，且环境污染严重[2]。茭白叶中富含一定黄酮类物质[3]。目前，提取黄酮类物质的方法主要有醇提法、微波提取法和超声波提取法等[4-5]。其中，以超声波提取法效果最佳。在现有文献中，仅有一篇论文利用微波法提取茭白叶黄酮[3]。以茭白叶为原料，利用超声波法提取茭白叶中的黄酮类物质，以期为茭白的综合价值开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茭白叶，武汉市中百仓储超市中废弃的茭白叶；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯；芦丁标准品，合肥博美生物公司提供；DPPH分析纯，安徽酷尔生物工程有限公司提供。

茭白叶的处理方法：将新鲜茭白叶洗净切碎，放入60 ℃恒温干燥箱中烘干至茭白叶内部无明显水分，利用植物粉碎机粉碎后过40 目筛，备用。

1.2 仪器与设备

FZ102 型微型植物粉碎机，上海科恒实业发展有限公司产品；GZX-9070M型电热恒温数显鼓风烘箱，上海博讯有限公司产品；UV-100 型紫外分光光度计，上美析仪器有限公司产品；JA1001 型分析天平，奥豪斯仪器有限公司产品；HH-2 型恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；KQ500DB 型超声波清洗器，昆山舒美超声仪器有限公司产品；LD5-2A 型台式低速离心机，北京京立离心机有限公司产品；LPF-800T 型粉碎机，永康市红太阳机电有限公司产品。

1.3 黄酮标准曲线的绘制

称取芦丁纯品0.01 g，再取体积分数80%乙醇溶液50 mL，配置得到质量浓度0.2 mg/mL 的芦丁标准溶液。以1 mL 为单位，取5 种不同分量的溶液放在具塞刻度试管中，加入质量分数5%亚硝酸钠0.3 mL，静置6 min，再加质量分数10%硝酸铝0.3 mL，静置6 min，最后加入质量分数4%氢氧化钠4.0 mL 后加水至刻度，摇晃均匀，静置12 min 后于波长510 nm处测其黄酮含量，将波长510 nm 处测得的吸光度（A） 作为纵坐标，芦丁标准液质量浓度（C） 作为横坐标做回归曲线，得出回归方程。

1.4 超声波法提取茭白叶黄酮单因素试验

分别以料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度及超声功率为单因素，在其中一个因素进行试验时，其他因素条件均为定值（料液比1∶30，乙醇体积分数60%，提取时间20 min，提取温度50 ℃，超声功率450 W）。

单因素试验方法：准确称取5 份1.00 g 茭白叶粉末，将其分别放置在具塞比色管中，按照料液比（m/V） （1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40），加入体积分数为（40%，50%，60%，70%，80%）的乙醇溶液，置于（30，40，50，60，70 ℃）、功率为（150，300，450，600，750 W） 的超声波清洗器中（10，15，20，25，30 min） 后，在转速4 200 r/min离心10 min，取上清液，将样液稀释至吸光度为0.400～0.700，于波长510 nm 条件下利用分光光度计比色，计算其黄酮类物质的含量。

1.5 超声波法提取茭白叶黄酮正交试验设计

以黄酮类物质的提取率为标准设计正交试验，从5 个单因素中选出影响较大的4 个单因素，设计正交试验。

超声波法提取茭白叶总黄酮的正交试验因素与水平设计见表1。

表1 超声波法提取茭白叶总黄酮的正交试验因素与水平设计

1.6 茭白叶黄酮粗提物对油脂氧化的抑制试验

将茭白叶黄酮粗提物按0.05%（质量比） 的比例添加到大豆油中，并放置在65 ℃的烘箱中，测定过氧化值，定期观察其抗氧化程度。

1.7 茭白叶黄酮提取率的计算

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 体系络合化学吸收法测定黄酮[6]。按如下公式计算茭白黄酮提取率：

式中：Y——黄酮类物质的含量，%；

C——根据标准曲线求得的黄酮类物质的质量浓度，mg/mL；

N——稀释倍数；

V——定容体积，mL；

W——茭白的质量，mg。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准曲线的绘制见图1。

图1 芦丁标准曲线的绘制

由图1 可知，得到回归曲线方程为：

Y=0.507 6X+0.010 3，R2=0.998 3.

式中：Y——测定样品的吸光度；

X——芦丁质量浓度，mg/mL。

2.2 不同料液比对茭白叶黄酮提取率的影响

不同料液比对茭白叶黄酮提取率的影响见图2。

图2 不同料液比对茭白叶黄酮提取率的影响

由图2 可知，随着料液比增加，茭白叶黄酮类物质提取率不断升高，料液比在1∶30 后，上升幅度不大。当料液比较低时，溶剂量越大，茭白叶黄酮溶出量越高，这是由于一定量溶剂有利于将茭白叶黄酮溶出，当料液比达到1∶30 后，随着料液比的提高，茭白叶黄酮提取效果提高的不够明显，这可能是由于乙醇溶液对茭白叶黄酮的提取达到了饱和，当继续增大乙醇体积分数时，其他醇溶性杂质被溶出[6]，从而导致黄酮类化合物的减少，考虑到提取工艺成本，选择正交设计料液比为1∶25～1∶35。

2.3 不同乙醇体积分数对茭白叶黄酮提取率的影响

不同乙醇体积分数对茭白叶黄酮提取率的影响见图3。

由图3 可知，茭白叶黄酮提取率呈现先上升、后下降的趋势。较高的乙醇体积分数加速黄酮类物质的溶出，当乙醇体积分数大于60%后，可能存在部分醇溶性杂质，与黄酮类化合物竞争，从而使黄酮类化合物溶出量减少。因此，选择正交设计的乙醇体积分数为50%～70%。

图3 不同乙醇体积分数对茭白叶黄酮提取率的影响

2.4 不同提取温度对茭白叶黄酮提取率的影响

不同提取温度对茭白叶黄酮提取率的影响见图4。

图4 不同提取温度对茭白叶黄酮提取率的影响

由图4 可知，提取温度为50 ℃时，达到最佳提取率。温度适当升高，分子运动加剧，提取率升高，但温度过高后，极少量黄酮类物质不稳定，导致提取率稍有下降。因此，选择最优提取温度为50 ℃。

2.5 不同提取时间对茭白叶黄酮提取率的影响

不同提取时间对茭白叶黄酮提取率的影响见图5。

图5 不同提取时间对茭白叶黄酮提取率的影响

由图5 可知，提取时间越长，溶剂能够充分渗透至茭白叶组织中，将黄酮类物质充分溶解，黄酮提取率增加，在20 min 时达到最高点，但继续超声波提取后，黄酮提取率稍稍下降，但下降趋势不明显，这主要是由于黄酮类物质在长时间超声波条件下，可能发生降解。因此，选择正交试验的提取时间为15～25 min。

2.6 不同超声功率对茭白叶黄酮提取率的影响

不同超声功率对茭白叶黄酮提取率的影响见图6。

图6 不同超声功率对茭白叶黄酮提取率的影响

由图6 可知，随着超声功率增加，黄酮提取率提高，在450 W 处达到最高值，之后有大幅度下降。这主要是由于超声波在液体中产生“空穴作用”，使分子运动加剧，溶质更易扩散，植物细胞及细胞膜结构破坏，有助于黄酮类物质的释放与溶出，提取时间缩短。随着超声功率的增加，溶剂将茭白叶中的其他醇溶性杂质溶出，茭白黄酮类物质溶出量减少，且功率较高时，增加了黄酮类物质降解的机率。因此，超声功率为300～600 W 时较适宜。

2.7 超声波法提取茭白叶黄酮类物质正交试验设计

超声波法提取茭白叶总黄酮的正交试验结果见表2。

表2 超声波法提取茭白叶总黄酮的正交试验结果

由表2 可知，茭白叶黄酮含量影响因素的主次顺序依次为乙醇体积分数（A） ＞料液比（B） ＞超声功率（D） ＞超声时间（C）。最优工艺条件为A2B2C3D2，即乙醇体积分数60%，料液比1∶30，超声时间25 min，超声功率450 W，在此条件下进行验证试验，得到茭白叶黄酮的得率为3.675%。

2.8 茭白叶黄酮粗提物对油脂氧化的抑制试验

不同质量分数茭白叶黄酮粗提物对油脂氧化的抑制作用比较见图7。

由图7 可知，茭白叶黄酮粗提物对油脂具有较好的抗氧化作用，同质量分数的茭白叶黄酮与维C的抗氧化作用相当。

图7 不同质量分数茭白叶黄酮粗提物对油脂氧化的抑制作用比较

3 结论

超声波法提取茭白叶黄酮的最优工艺条件为乙醇体积分数60%，料液比1∶30，超声时间25 min，超声温度50 ℃，超声功率450 W。茭白叶黄酮粗提物对油脂有良好的抗氧化能力，与同含量的维C 抗氧化效果相当。茭白叶黄酮是天然的抗氧化剂，其安全性好，是一种非常有前途的天然抗氧化剂。