WD重复结构域相关蛋白3对胃恶性肿瘤细胞增殖的影响

贾佳 王琦 卢光新 金灵莉

胃癌是全球第五大最常见的恶性肿瘤，是导致癌症死亡的第三大原因，然而胃癌发生的确切分子机制尚不清楚[1]，阻碍了个性化治疗策略的发展，因此，寻找可靠的胃部恶性肿瘤治疗性分子标记物至关重要。WD重复结构域相关蛋白3(RFWD3)参与DNA的损伤修复[2]；125碘(125I)粒子放疗对裸鼠肝癌起到抑制作用，通过下调RFWD3表达抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡，成为晚期胃癌重要的辅助治疗手段[3]，但RFWD3表达与胃癌的发生、发展及预后也尚不清楚。本研究通过对癌症基因谱图谱(TCGA)数据库及mRNA芯片数据分析、进行细胞功能学试验等，探索可能的分子生物学机制，论证RFWD3作为胃癌分子靶向治疗潜在靶点的可能性。

材料与方法

1.材料：通过TCGA数据库选取RNAseqV2的成对样本数据进行分析。TCGA数据库现存443个有可用数据的样本，其中有RNAseqv2成对样本数据且有病理信息的一共32对，根据32对样本的barcode信息，使用TMM(Trimmd Mean of M-Values)法过滤样本。细胞株、主要试剂和仪器：人胃腺癌细胞株AGS、人胃癌细胞株MGC-803、人胃腺癌细胞株BGC-823、人胃腺癌细胞株SGC-7901均购于上海吉凯基因公司；Trizol购于上海普飞生物有限公司；GV115载体、TOP10大肠杆菌感受态细胞、Oligo dT购于上海国药集团化学试剂有限公司；DNA sequencing购于上海美季生物有限公司；分光光度计Thermo、荧光显微镜、奥林巴斯凝胶成像仪购于上海天能科技有限公司。

2.方法

(1)筛选候选基因：对于多个成对样本的统计，首先估算离散度，然后用一般线性模型估算基因在不同分组间是否有差异，同时采用计算方法log2(Cancer/Normal)过滤标准为≥1或≤-1，最终确定用于分析的基因列表。

(2)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测RFWD3 mRNA在不同胃癌细胞中的表达：收集细胞，提取AGS、MGC-803、BGC-823、SGC-7901 4种细胞的总RNA，反转录获得cDNA，RFWD3引物序列：上游引物5’-GACCAACTTCATCAGCGGACT-3’，下游引物5’CCTGCAACTCTTCAGATACAGGA-3’。采用2-ΔΔct反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平。

(3)构建载体，收获慢病毒：以RFWD3基因为模板，设计RNA干扰靶点序列，合成含干扰序列的单链DNA oligo,退火配对，产生双链DNA，通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体，将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞TOP 10,送测序验证，对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提；质粒载体制备完毕，转染293T细胞，转染完成48～72 h进行病毒收获，然后离心浓缩去除杂质，纯化后样品分装。

(4)慢病毒感染胃腺癌细胞AGS：复苏液氮中的胃腺癌细胞AGS，待细胞汇合度达80%左右传代培养，取处于对数生长期的贴壁细胞，完全培养基制成3～5×104/ml细胞悬液，将其分为shCtrl组和shRFWD3组，加入最适病毒进行感染(按预实验结果)，8～12 h左右更换常规培养基，观察感染后细胞状态及感染率。

(5)RT-PCR检测细胞中mRNA水平RFWD3基因消减效率：经慢病毒感染72 h后，采用RT-PCR检测shRFWD3组胃腺癌细胞AGS中RFWD3基因在mRNA水平的表达情况，进而判断靶点的干扰效果。

(6)使用Celigo仪检测RFWD3基因消除对细胞增殖的影响：将处于对数生长期的各实验组细胞采用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液后计数；根据细胞生长速度决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为2 000)，每组3个复孔，培养体系为100 μl/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养；每天使用Celigo仪检测读板一次，连续3～5天；通过调整分析设置的输入参数，准确计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线，然后进行数据分析。

(7)比色法(MTT)检测胃腺癌细胞AGS的增殖：分为shCtrl组和shRFWD3组，采用shRNA慢病毒感染AGS细胞，培养5天后，经MTT法处理后观察，采用多功能酶标仪在490 nm处检测细胞光密度值。

结 果

1.TCGA数据过滤与标准化：胃癌在TCGA数据库现存443个可用数据的样本，其中RNAseq数据样本有416个，有RNAseqV2成对样本数据且有病理信息的一共32对，根据样本的barcode信息，拆分出32个成对样本的原始数据文件，显示大部分样本Normal(癌旁)与Cancer(癌症)样本被明显分离开，而编号27～32的样本表现则与其他有明显差异。前26个成对样本数据具有较高稳定性，更适合进行后续分析，因此对32个样本和26个样本的分组均进行计算。过滤后的26对样本通过差异基因列表获取。

2.RFWD3基因筛选：候选基因筛选，通过标准设定有效减少筛选目的基因数量：(1)去除本项目所研究的癌种已有功能与临床相关性SCI论文报道的基因；(2)去除多次跨膜蛋白基因；(3)去除PubMed中相关文章数量>100的；相关的数据来源均为可靠度较高的基因疾病数据库，最终得到的基因列表经过一定的随机浓缩，经过Card基因分析结果，得到最终RFWD3。

3.RFWD3在4种胃癌细胞中mRNA的表达比较：RFWD3 mRNA在4种胃癌细胞中的表达均较高，在AGS中最高(P<0.05)。见图1。

图1 RFWD3 mRNA在不同细胞中的表达

4.shRNA慢病毒感染胃腺癌细胞AGS：胃腺癌细胞AGS经过shRNA慢病毒感染72 h后显微镜下荧光观察结果显示，shCtrl组细胞感染效率较低，而shRFWD3组细胞感染效率达到80%以上，两组细胞状态均正常。见图2、3。

图2 显微镜下shCtrl组细胞的慢病毒感染结果(A：明视野，×100；B：明视野，×200；C：荧光视野，×100；D：荧光视野，×200)

图3 显微镜下shRFWD3组细胞的慢病毒感染结果(A：明视野，×100；B：明视野，×200；C：荧光视野，×100；D：荧光视野，×200)

5.胃腺癌细胞AGS中RFWD3基因敲减率：经shRNA慢病毒感染后，实验组胃腺癌细胞AGS中RFWD3基因在mRNA水平的表达量受到抑制(P<0.05)，敲减率达50.7%。见图4。

图4 基因RFWD3敲减后mRNA表达丰度比较(注：aP<0.05)

6.两组胃腺癌细胞AGS中敲除RFWD3基因后比较：Celigo仪检测结果显示，经shRNA慢病毒感染AGS细胞72 h后，与shCtrl组比较，shRFWD3组的细胞数量及倍数增加明显降低(P<0.05)，提示细胞增殖抑制明显。见图5。

图5 慢病毒感染细胞后RFWD3敲减组的变化(A:细胞计数；B：细胞计数倍数)

7.两组胃癌细胞AGS增殖情况比较：与shCtrl组相比较，shRFWD3组细胞吸收率随时间及倍数的增加而降低(P<0.05)，提示细胞增殖抑制明显，见图6。

图6 RFWD3对胃腺癌细胞AGS增殖的影响(A:吸收率；B:吸收率倍数)

讨 论

RFWD3是ATM/ATR磷酸化底物，参与DNA损伤后的修复过程[4-5]。DNA损伤修复时，RFWD3被停止在复制叉处积累，与复制蛋白A(RPA)共同定位，并通过WD40域与RPA相结合，在同源重组(HR)之后促进复制叉重新启动，通过这一机制发现RFWD3突变与Fanconi贫血相关[6]；有文献报道，RFWD3参与了恶性睾丸生殖细胞肿瘤的发病机制[7]；也有报道RFWD3基因下调能够抑制非小细胞肺癌的集落形成，与疾病预后具有相关性，且发现吸烟者的RFWD3基因表达水平明显高于非吸烟者[8]；在多发性骨髓瘤广泛基因关联性研究中，RFWD3属于易感位点之一，为深入了解肿瘤的提供生物学基础[9]。但RFWD3与胃癌相关性的报道尚未发现，本实验旨在探讨RFWD3是否能够成为胃癌治疗的潜在靶点。

本实验首先从TCGA数据库的大量样本中分离Normal(癌旁)与Cancer(癌症)，然后通过差异基因分析，有效减少目的基因数量，随机浓缩从Card基因表中得出RFWD3,但上述实验仅能说明该基因在肿瘤中呈高表达，与RFWD3蛋白在肝细胞癌中高表达相一致，该文献是通过基因芯片和抗体芯片探讨该基因在肝癌中的生物学机制[10]，说明与肝癌有相关性，但其与胃癌的相关性和机制尚不明确。本实验进一步通过RT-PCR检测在4种胃癌细胞中发现，RFWD3不仅高表达，且在胃腺癌细胞AGS表达水平极高。为探讨该基因在胃癌的发生、发展中是否起作用，进而进行下一步实验：采用慢病毒转染、感染胃腺癌AGS细胞，结果显示感染率在80%以上；之后进行RT-PCR检测发现,经shRNA慢病毒感染后，实验组胃腺癌细胞AGS中RFWD3基因敲减率>50.7%,说明其为有效靶点，并且可以用于进行细胞功能学实验。为探讨RFWD3基因对胃癌细胞增殖的影响，本实验使用Celigo仪检测RFWD3基因消减对细胞增殖的影响，结果显示，胃腺癌细胞AGS的增殖速率受到显著抑制，提示RFWD3基因与胃腺癌细胞AGS的增殖能力具有显著相关性,进一步通过MTT检测RFWD3基因消减对细胞增殖的影响,结果显示，经shRNA慢病毒感染72 h后，实验组胃腺癌细胞AGS的增殖速率受到显著抑制，也同样提示RFWD3基因与胃腺癌细胞AGS的增殖能力显著相关。综合上述实验结果，可以看出干扰目的基因RFWD3对胃腺癌细胞AGS具有抑制其增殖的作用，但本实验未对该基因在蛋白水平及对细胞周期的影响进行检测，有待进一步研究。

在近十年的国外报道中，RFWD3基因对DNA损伤修复的研究较多，如RFWD3是一种E3泛素连接酶，以单链DNA蛋白、RPA、重组酶RAD51和人类抑癌基因P53为靶点；如最新报道在果蝇中发现RFWD3发挥的作用不同于其他哺乳动物，由于果蝇中存在Mus302，所以能够保留RFWD3的原始作用[11-13],而涉及对恶性肿瘤影响的研究较少，尤其是该基因对肿瘤细胞影响的机制更为罕见。

综上所述，本实验通过TCGA数据库分析RFWD3与癌旁、癌症组织的关系、通过部分功能学实验，发现RFWD3能够抑制胃癌细胞AGS的增殖，但其是否是通过DNA损伤影响了RFWD3基因尚不明确，有待进一步研究深入探讨。