鼠精原干细胞分离鉴定方法的应用及体外培养体系研究进展

陈琰，李兴元，胡文慧，姚金玲，孔德营

遵义医科大学基础医学院生理学教研室，贵州遵义563000

精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是雄性哺乳动物体内惟一可以将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。SSCs 存在于曲细精管基膜上，可不断自我更新，在成年雄性睾丸中可分化为精母细胞。SSCs 分化而来的精母细胞进一步分化为精子，从而将遗传信息传递给子代。SSCs 的分离与体外培养对生殖医学及动物分子育种具有重要的意义。SSCs 具有永生和多能的特征，是精子的前体细胞。通过体内获取精原干细胞，再以显微注射技术将精原干细胞移植到受体的睾丸网当中，使移植的SSCs在受体睾丸内不断增殖、分化并形成精子是目前临床治疗男性不育症的重要方法之一。随着体外研究的不断深入，SSCs 的形态功能特征、生理生化特性、细胞移植技术及其在精子发生中的调控机制也逐渐清晰，为SSCs 应用于各种体内外因素，如内分泌紊乱、化学污染、以及因青春期前淋巴瘤或白血病等接受全身大剂量化疗后导致的无精或少精性不育症的临床治疗，以及在制备转基因动物和保护濒危物种等方面的应用提供了理论依据［1］。本文主要对小鼠、大鼠这两种实验研究中最常用的模型动物中SSCs 分离鉴定方法的应用与体外培养体系最新研究进展综述如下。

1 鼠SSCs分离方法的应用

SSCs 存在于雄性动物的各个年龄阶段，即可随时从雄性动物体内分离出SSCs。在动物出生后的生长发育过程中，SSCs 会不断的分化增殖为各级生精细胞。因此，随年龄增长，精原干细胞在生殖细胞中的占比将逐渐减少。研究［2］表明，新出生的小鼠睾丸组织中SSCs 所占比例可以达到1.41%，而成年小鼠睾丸组织中SSCs 所占比例大幅下降，只有0.02%～0.03%。目前，我们在实验过程中一般选择出生第4～8 天的小鼠［3］或者出生第9 天的大鼠［4］为研究对象分离SSCs。

MEISTRICH 等［5］采用胰蛋白酶结合DNaseⅠ对小鼠SSCs 进行分离，得到的SSCs 纯度较低，这种分离方法称为一步分离法。后来SSCs的分离方法发展成两步法。即首先用机械方法剪碎睾丸组织，然后用胶原酶、透明质酸酶和DNase等3种酶对碎组织进行处理，获得单细胞悬液，再通过纯化处理，获得精原干细胞。其中常用的纯化方法有差速贴壁法、密度梯度法、免疫磁珠分选法以及流式细胞分选法等。

1.1 差速贴壁法在SSCs 分离中的应用 经机械方法及酶消化分离法得到的SSCs 悬液中混杂着支持细胞。精原干细胞和支持细胞在经过明胶处理的培养皿中贴壁速度不同，差速贴壁法就是利用此原理对SSCs 进行纯化首先用饲养层细胞培养液重悬分离得到的细胞并计数，然后将细胞悬液移至明胶包被的培养皿，于37 ℃、5%CO2环境中培养。因支持细胞贴壁速度快于SSCs，大部分支持细胞在短时间内即可完成贴壁，而SSCs 在短时间内尚未贴壁或贴壁不牢，所以在培养一定时间后，轻轻吹打细胞，将未贴壁的细胞移至新的明胶包被的培养皿中进行培养。在相同的条件下，再重复一次上述操作，吸出上层细胞悬液离心得到SSCs。然后用SSCs培养液重悬离心后的细胞并移至新的明胶包被的培养皿中，过夜培养。次日将含有未贴壁细胞的培养液移至铺有饲养层细胞的培养皿中，在37 ℃、5%CO2环境中培养。

差速贴壁法对实验条件无特殊要求，操作简单易行，因而常用于大鼠、小鼠等实验动物SSCs 的纯化。王庆钟等［6］利用差速贴壁法分离纯化大鼠SSCs，并后期体外培养成功，建立起大鼠SSCs 的分离、筛选、培养体系。同时，应用差速贴壁法也同样适用于小鼠SSCs 的分离纯化。凡志国等［7］通过4 次重复的差速贴壁法获得纯度达70%以上的SSCs。

1.2 Percoll 密度梯度离心法在SSCs 分离中的应用 Percoll 是一种经聚乙烯吡咯烷酮（PVP）处理的硅胶颗粒，具有渗透性低、不穿透细胞、粘度小、密度大和无毒害等特点。首先需要配制浓度递减的Percoll 分离液，将其依次加入离心管中，再将待分离的细胞悬液置于最上层，离心后用注射器将目的细胞带移至事先做好标记的离心管中，最后再将目的细胞条带离心、重悬，从而收集到较高纯度的SSCs。该方法操作简单易行，但单纯使用这种方法得到的SSCs 纯度相对较低。目前研究者们通常将该法与差速贴壁法联合应用，从而得到纯度更高的SSCs。王翠玲等［8］分离得到小鼠SSCs 后，先后采用密度梯度法和差速贴壁法对其纯化，最终获得的SSCs 纯度高达64.42%。王永彬等［9］通过percoll 法初步分选SSCs，然后再利用差速贴壁法进一步分选纯化SSCs，最终得到纯度高达87%的小鼠SSCs。

1.3 免疫磁珠分选法在SSCs 分离中的应用 免疫磁珠是与特异性的抗体结合的超顺磁性颗粒（即带有磁力的抗体），直径只有50 nm 左右，可与细胞表面的特定抗原结合，免疫磁珠的这种特性非常适用于SSCs的分离。使用免疫磁珠分选法提取SSCs时，首先需将经酶消化得到的睾丸细胞悬液与免疫磁珠混合孵育，然后置于磁场中，其中被磁珠吸附的SSCs 经buffer 重悬培养，而未被磁珠吸附的细胞悬液（主要含支持细胞）可丢弃或作为饲养层细胞。利用该方法可以获得较高纯度的SSCs。KUBOTA 等［10］通过胸腺细胞抗原1（thymus cell antigen 1，THY1）抗体耦联磁珠对小鼠SSCs 进行纯化处理时发现，与对照组相比，Thy-1 微珠可使成年小鼠SSCs 的富集程度提高30 倍，说明免疫磁珠分选法是目前分离SSCs较为高效的方法。

1.4 流式细胞分选法在SSCs 分离中的应用 流式细胞分选法是将SSCs 的特异性标识分子与免疫荧光抗体结合，而后荧光信号被转换为电信号，通过流式细胞分选仪分选出带有荧光信号的细胞，从而较精确地获得较高纯度SSCs 的方法。刘建兵等［11］先用percoll 法分离睾丸细胞，然后通过流式细胞富集THY1 阳性的精原干细胞，得到细胞纯度达到80.4%的SSCs。HAMRA 等［12］用流式细胞分选法则获得了纯度约90%的大鼠SSCs。由于流式细胞分选法在实际应用时对实验条件及操作要求较高，因此实验的重复性较差。

2 鼠SSCs鉴定方法的应用

SSCs 的鉴定主要是利用其特异性表面标志物，结合荧光定量PCR 法以及免疫组织化学法等进行。SSCs 的特异性表面标志物常见的有胶质细胞源性神经营养因子家族受体α1（glial cell line derived neurotrophic factor family receptor alpha 1，GFRA1）、死盒解旋酶4（DEAD box helicase 4，DDX4）、锌指和BTB 结构域包含16（zinc finger and BTB domain containing 16，ZBTB16）等［13-14］，但SSCs 的特异性表面标志物只是相对特异，因为其表面标志物往往在睾丸的其他生精细胞中也有表达，只是在SSCs 上表达的量相对较多。

由于SSCs 同时具有干细胞的特性，因此也可以表达干细胞的特异性标记蛋白，如POU 结构域，第5类、转录因子1（POU domain，class 5，transcription factor 1，POU5F1）和SRY（性别决定区Y）-框2［SRY（sex determining region Y）-box 2，SOX2］等［15］。根据SSCs 的这种特性，可通过多种表面标志分子共同标记的方法对其进行准确鉴定。

当体外培养的细胞同时表达生殖细胞标记蛋白，如GFRA1、DDX4、ZBTB16 等中的一种或多种以及多功能干细胞标记蛋白，如POU5F1 和SOX2 等中的一种或多种时，说明分离的细胞兼具生殖细胞和干细胞的特性，即可认定该细胞是SSCs。

3 鼠SSCs体外培养体系

在SSCs体外培养研究的初期，由于存在SSCs体内含量低、培养体系不够完善、离体后保持未分化状态的时间较短以及特异标志物缺乏等条件的限制，使得最初的SSCs 体外培养研究具有分离纯度低、培养时间短等特点。随着SSCs 高效分离纯化技术的出现以及体外培养条件的不断优化，大、小鼠SSCs体外培养技术已日趋成熟。SSCs 的体外培养体系最初不包含血清及饲养层。KANATSUSHINOHARA 等［16］于2008 年成功建立首个以粘连蛋白涂层为基础，辅以血清和生长因子成分的小鼠SSCs 培养体系，该体系已成为目前人们从事SSCs 体外培养研究的基础。后来，研究人员发现，饲养层细胞在SSCs的长期培养中至关重要，因此目前的SSCs体外培养体系中，饲养层细胞不可或缺，这也使得SSCs体外培养体系得到进一步完善。目前建立SSCs 体外培养体系的条件主要包括基础培养基、适宜的温度、饲养层细胞、血清及生长因子等。

3.1 培养基的选择 不同实验动物的SSCs 所处微观环境不同，对基础培养基的要求也有一定的差异。目前常用的SSCs培养基主要有DMEM、MEM以及SFM 等［17］。在小鼠的SSCs 体外培养研究中，KANATU-SHINOHARA 等［18］使 用StemPro-34SFM 培 养基较为成功，该培养基培养小鼠SSCs 可达到6 个月之久。在大鼠SSCs 体外培养的研究中，HAMRA等［12］使用DMEM/F12培养基，使大鼠的SSCs在体外培养长达151 天，传代12 次，细胞扩增了2 万倍，且培养所得细胞的细胞活性保持较好。张仙玉等［19］通过实验对比了DMEM/F12、DMEM（高糖）和Stem-Pro-34SFM 培养基的SSCs 培养效果，发现StemPro-34SFM 的培养效果优于DMEM/F12 以及DMEM（高糖），可见StemPro-34SFM可能是目前大鼠SSCs培养基的最优选择。

3.2 饲养层的选择 饲养层细胞可更好地延长SSCs 的体外培养时长。GUAN 等［19-20］在对小鼠的SSCs的体外培养研究中证明，没有饲养层的SSCs 在培养7 d 后，细胞数会减少至初始状态的10%～20%。这主要是因为饲养层细胞具有分泌生长因子，促进SSCs 的分裂增殖［21］并抑制细胞分化的功能。小鼠SSCs 常用的饲养层为小鼠成纤维细胞（SIM mouse embroy-derived thioguanine and ouabian resistant，STO）［20］、小鼠胎儿成纤维细胞（Mouse fetal fibroblasts，mEF）。张仙玉等［19］以mEF 细胞为饲养层使得精原干细胞能够在体外稳定培养。饲养层细胞可能通过分泌碱性成纤维细胞生长因子2、转化生长因子-β2 以及细胞外基质蛋白等多种促生长因子，参与维持SSCs的稳定体外培养。LIU 等［22-23］以人羊膜 上 皮 细 胞（Human amniotic epithelial cells，HAECs）和小鼠骨髓基质细胞作为小鼠SSCs 饲养层细胞，也可实现了SSCs 的体外长期培养。而大鼠的SSCs 则更适合使用间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）作为饲养层进行培养［24］。

3.3 血清添加 血清在SSCs 的体外培养中，既有利于SSCs 的早期建系，又可减少细胞代谢产物的毒性作用，还可以为细胞提供营养。但血清也会产生一些不良作用，比如可导致SSCs 分化等。但总体而言，血清在SSCs 的体外培养中是利大于弊的［20］。孙源等［25］在小鼠SSCs 培养体系的研究中，建立起无血清的培养体系，且SSCs 经过15 次传代培养，仍可保持不分化的状态。GUAN 等［20］在小鼠SSCs 培养基中加入了胎牛血清，发现血清除了有利于SSCs 的克隆增殖外，还延长了其培养时长（113 d）。DOVERE等［26］在小鼠的SSCs 培养基中添加不同体积分数的血清，发现低含量的血清可促进SSCs 克隆，而高含量血清则无此效果。

3.4 生长因子的选择 生长因子可以调控SSCs 的更新和分化，其作用效果与其在培养基中的浓度以及因子间的相互作用等因素有关［27］。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）等生长因子在不同的小鼠SSCs 培养体系中，分别发挥促进SSCs 增殖的作用［28］。KANATSUSHINOHARA 等［16］所构建的小鼠SSCs 培养体系中，10 000 U/mL 的LIF 和100 ng/mL 的bFGF 可显 著提高SSCs 的活性，而胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）EGF、以及GDNF 等生长因子则不具备促进SSCs 增殖的作用。索丽娟等［29］研究结果表明，1 000 U/mL 的LIF 和20 ng/mL 的GDNF联合应用也可促进SSCs 的增殖。但也有研究持相反意见，一项小鼠SSCs的体外培养研究［7］中发现，培养体系中只添加单个生长因子EGF 时对SSCs 的增殖作用最佳，相反，在培养体系中同时添加多种营养因子，并没有达到促进SSCs增殖的效果。

3.5 环境温度选择 SSCs 体外培养的温度一般采用体腔温度，即37 ℃。由于动物的睾丸温度低于体腔温度，在体腔温度下培养不利于生精细胞的生长。因此，体腔温度有利于去除SSCs 之外的其他生精细胞。但李莲军等［30-31］研究发现，32 ℃～37 ℃的环境温度适合小鼠SSCs的体外培养，但34 ℃环境温度可促进SSCs 的增殖并维持其细胞活性。另有研究［32］发现，32 ℃更有利于A型大鼠SSCs的体外培养。

综上所述，目前常用的鼠SSCs 的分离方法为两步分离法，首先用机械方法剪碎睾丸组织，然后用胶原酶、透明质酸酶和DNase 等3 种酶对碎组织进行处理，获得单细胞悬液，机械分离和酶消化细胞后，采用差速贴壁法、密度梯度法、免疫磁珠分选法或流式细胞分选法等纯化SSCs。SSCs 的鉴定主要采用荧光定量PCR 法和免疫组织化学法鉴定GFRA1、DDX4、锌指和ZBTB16SSCs 等特异性标志物可的鉴定主要是以其特异性标志物。SSCs 的体外培养体系中基础培养基和适宜的温度是培养的必要条件，饲养层细胞、血清以及生长因子等也必不可少。目前研究已对SSCs 在睾丸中的增殖、分化机制有了较为清楚的认识，这使得SSCs在体外保存并通过器官培养将其诱导分化为精子成为可能。通过SSCs 体外培养并借助基因修饰技术进行男性不育症的治疗以及遗传性疾病的生殖细胞基因治疗将是该领域科研人员未来关注的重要方向。