胃癌预后相关铁死亡基因筛选及预后预测模型构建

袁漫秋，裴建赢，何鑫，田丽荣，胥敏敏，李燕平

1 兰州大学，兰州 730000；2 甘肃省妇幼保健院科研中心；3 兰州大学第一医院检验科

胃癌的发病率（5.7%）和病死率（8.2%）在消化道肿瘤中仅次于结直肠癌［1］。因此，寻找与胃癌预后相关的分子标志物、评估胃癌患者的预后风险对指导临床决策、提高患者生存率具有重要意义。铁死亡是一种新型的细胞程序性死亡方式，在形态、生化和遗传学上都区别于细胞凋亡、坏死和自噬等细胞死亡。铁死亡的发生与铁依赖过氧化脂质的积聚并导致细胞的致命性损伤有关［2］。研究［3］发现，铁死亡参与调节肝癌、乳腺癌等癌症的发生发展。铁死亡在胃癌细胞中能被显著抑制，促进肿瘤细胞的生长，降低癌细胞对顺铂和紫杉醇等药物的敏感性。阿帕替尼能通过降低癌细胞谷胱甘肽水平、增加脂质过氧化水平诱导胃癌细胞的铁死亡，发挥抗肿瘤作用［4］。目前与铁死亡相关的基因研究已有较多，但铁死亡相关差异表达基因与胃癌预后的关系目前并不十分清楚［5］。我们采取生物信息学方法筛选与胃癌预后相关的铁死亡基因并分析其生物学功能，进一步构建胃癌预后预测模型，对胃癌患者的预后风险进行评估。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 数据来源 在可公开获得的癌症基因组图谱（TCGA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中检索并下载胃癌基因微阵列图谱及相关患者的临床资料，将患者临床资料和基因表达信息合并后删除缺失值。胃癌基因微阵列图谱包含胃癌基因的名称、样本编号以及基因在不同样本中的表达量。患者的临床信息主要包括年龄、性别、TNM 分级、肿瘤分期、生存时间、生存状态。共计获得407 例标本，其中胃癌组织375例份、癌旁组织32例份。删除缺乏随访信息的标本，最终获得胃癌组织311例份、癌旁组织32例份，共包含60个铁死亡基因的相关信息。

1.2 与胃癌预后相关的铁死亡基因筛选

1.2.1 胃癌、癌旁组织铁死亡基因筛选 通过R软件中的“limma”软件包在纳入胃癌基因微阵列图谱信息中筛选铁死亡基因。以对数转换的差异表达倍数（FC，Fold Change，差异倍数）log2FC 的绝对值|log2FC|＞1和FDR＜0.05为标准，筛选为胃癌、癌旁组织铁死亡差异表达基因。

1.2.2 与胃癌患者预后相关的铁死亡基因筛选采用单因素Cox 回归分析法分析胃癌患者的总体生存率，筛选与胃癌患者预后相关的铁死亡基因（P＜0.05）。运用R 软件中的“Venn”软件包对铁死亡差异基因和胃癌患者的预后基因进行交集。最后筛选得到胃癌预后相关的铁死亡基因。

1.2.3 胃癌预后相关铁死亡基因的生物学功能分析 采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）软 件（https//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）探索胃癌预后相关铁死亡基因高表达时的富集通路（NOMP＜0.05、FDR＜0.05），分析胃癌预后相关铁死亡基因的生物学功能。

1.3 胃癌预后预测模型构建与验证

1.3.1 胃癌预后预测模型构建 纳入“1.2”得到的胃癌预后相关的铁死亡基因，运用Lasso Cox 回归分析法，使用“glmnet”软件包构建胃癌预后相关的铁死亡基因的预测模型，即：胃癌预后预测模型=eK1X1+K2X2+……KnXn。其中X 代表预后相关的铁死亡基因的表达量，K 代表系数。Kn是以预后相关的铁死亡基因Xn的表达量为自变量，以胃癌患者的总体生存率和生存状态为因变量计算得到的系数。

1.3.2 胃癌预后预测模型准确性验证 根据预后预测模型计算数据集中随访信息完整的胃癌组织311 例份，并根据评分中位数将纳入的胃癌患者分为高、低风险组。下一步采用“survival”、“survminer”软件包对高、低风险组胃癌患者的生存情况进行分析，绘制生存曲线。通过“timeROC”软件包绘制受试者工作特征曲线（ROC），并评估预后预测模型准确性。采用“Rtsne”、“ggplot2”软件包对模型基因中纳入的铁死亡相关差异表达基因进行主成分（Principal Component Analysis，PCA）、t分布随机邻居嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）分析，通过变量降维验证预后预测模型预后评分对高、低风险的患者预后的区分程度。采用单因素Cox 回归分析、多因素Cox 回归分析法在“survival”软件包中评估铁死亡相关差异表达基因的胃癌预后预测模型测算的评分是否是独立于其它临床因素的预后因素。采用单样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）及“GSVA”软件包，对不同预后胃癌患者的免疫细胞、免疫通路进行评分，比较不同预后的胃癌患者免疫细胞、免疫通路差异。

2 结果

2.1 与胃癌患者预后相关的铁死亡基因及其生物学功能 胃癌组织、癌旁组织中有41 个（68.33%，41/60）铁死亡基因存在差异表达。其中，与癌旁组织比较，胃癌组织中ACSL3、CS、GCLC、HSBP1、

RPL8、GCLM、CARS1、SAT1、EMC2、G6PD、ABCC1、GSS、AIFM2、PHKG2、ALOX5、NFS1、ACACA、IREB2、ACSL4、CD44、GLS2、TP53、SQLE、FADS2、SLC7A11、TFRC、SLC1A5、FANCD2、NOX1 等29 个基因表达升高，CRYAB、AKR1C1、AKR1C2、MT1G、AKR1C3、HSPB1、ACSF2、NFE2L2、PEBP1、FTH1、NCOA4、ACO1等12个基因表达降低。

采用单因素Cox 回归分析法初步筛选得到胃癌患者预后相关的铁死亡基因有CHAC1、ZEB1、NFE2L2、KEAP1 及SLC1A5（HR分别为0.819，1.206，0.674，0.625，0.829；95%CI分别为0.676～0.991，1.022～1.424，0.456～0.997，0.432～0.904，0.703～0.997；P均＜0.05）。

通过Venn 图交集后得到胃癌患者预后相关的铁死亡基因为NFE2L2、SLC1A5。其中，NFE2L2 主要参与化学刺激检测、膜电位调节等生物学功能，SLC1A5主要参与金属离子传输、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性调节等生物学功能。

2.2 铁死亡相关差异表达基因的胃癌预后预测模型及其准确性 胃癌预后预测模型=e（-0.315×NFE2L2）＋（-0.161×SLC1A5）。其中，NFE2L2、SLC1A5 为胃癌组织中基因的相对表达量，-0.315、-0.161 分别为NFE2L2、SLC1A5的系数。

胃癌患者的预后评分模型测算出的患者预后评分对称分布、无离群值，提示该模型稳健。与预后低风险者（157 例）比较，预后高风险者（154 例）的生存率低（P均＜0.05）。第1、2、3 年铁死亡相关差异表达基因的胃癌预后预测模型预测患者预后的ROC曲线下面积分别为0.561、0.587、0.615。在患者生存状态和预后评分分布的散点图中可见，与预后低风险的胃癌患者比较，预后高风险的胃癌患者生存期短。PCA 分析、t-SNE 分析结果显示，变量降维后预后评分能有效区分胃癌患者预后的高、低风险。

单因素Cox 回归分析显示胃癌患者预后的危险因素为年龄、性别、TNM 分级、TNM 分期、预后评分（HR分别为1.802，1.329，1.229，1.828；95%CI分别为1.237～2.624，0.907～1.984，0.845～1.786，1.253～2.667；P均＜0.05）。多因素Cox 回归分析显示，胃癌患者预后的影响因素有年龄、TNM 分期、预后评分（HR分别为1.974，1.862，4.151；95%CI分别为1.350～2.885，1.277～2.717，1.822～9.459；P均＜0.05）。

与低风险胃癌患者比较，高风险胃癌患者肥大细胞、辅助T 细胞、B 细胞、TIL、树突状细胞（DCs）、中性粒细胞、Tfh 细胞等免疫细胞的评分高（P均＜0.05）。Ⅱ型干扰素反应、T 细胞共刺激等免疫通路的评分高，MHC_class_Ⅰ免疫通路的评分低（P均＜0.05）。

3 讨论

目前通过内镜下切除等治疗后早期胃癌的治愈率较高，但中、晚期患者经综合治疗后5年生存率仍较低［6］。胃癌的预后与肿瘤浸润程度、淋巴结转移、远处转移及治疗手段等密切相关。

铁死亡是由氧化剂和抗氧化剂之间产生的氧化还原失衡引起的一种新型细胞程序性死亡方式，其通过复杂的基因网络调控参与了包括胃癌等多种癌症的进程，在肿瘤细胞的生长、增殖中发挥了重要作用［7］。本研究利用生物信息学方法，最终得到与胃癌预后相关的铁死亡基因为NFE2L2、SLC1A5。NFE2L2，也被称为NRF2，是铁死亡过程中一个主要的转录因子，它可以协调铁死亡过程中大量参与铁代谢、氧化防御和氧化还原信号的细胞保护基因的活化。在同为消化道肿瘤的肝癌中，NEF2L2 参与铁死亡抵抗进而对肝癌细胞起到保护作用［4］。然而，也有实验表明，NFE2L2 激活的血红素氧化酶-1在铁死亡介导的过程中既可表显出保护作用，也可表现出细胞毒作用，因此NEF2L2 对肿瘤的具体行为并未完全确定［8］。本研究发现NFE2L2 表达量与预后情况正相关，可能提示保护作用，基因集富集分析提示NFE2L2 可能与化学刺激检测、膜电位调节等生物学功能有关。基因集富集分析提示SLC1A5与金属离子传输、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性调节等生物学功能有关。SLC1A5编码的丙氨酸—丝氨酸—半胱氨酸转运体-2（ASCT2）所介导的L-谷氨酰胺摄取是铁死亡的氨基酸代谢的重要组成部分，同时也参与多种肿瘤细胞的生长［9］。

本研究利用模型对数据集中所有胃癌患者的预后进行评分，并将患者分为高、低风险者。绘制的生存曲线显示高风险组相较于低风险的生存率显著降低，表明该模型是对胃癌患者预后风险的评估具有实用价值。该预后预测模型所得预后评分预测患者预后的敏感度、特异度均较高，且随时间推移，其预测患者预后的准确性有逐渐增加趋势。此外，根据预后评分散点图同样证实高、低风险组的生存率有显著差异；在PCA 分析、t-SNE 分析中，高、低风险组患者具有良好的区分，再次证实该预后评分模型的稳定性。最后，在独立预后分析中，该模型的预后评分成为继年龄、分期之后胃癌的独立预后因素。综上，本研究采用多种方法验证了该模型的有效性。

最后，本研究探寻了高风险组和低风险组在免疫学功能上的差异。结果显示肥大细胞、浆细胞样树突状细胞（pDCs）和B 细胞在高风险组中评分更高。高风险组中肥大细胞评分显著增高可能与肥大细胞在肿瘤微环境中分泌血管生成因子及淋巴管生成因子从而促进胃癌细胞的生长和转移有关［14］；pDCs 既能通过产生干扰素和白介素等细胞因子间接协调抗肿瘤免疫，又能作为抗原呈递细胞（APC）直接参与免疫过程［11］，B 细胞可以通过产生抗肿瘤抗体来抑制肿瘤的生长［12］。高风险组中pDCs、B 细胞的评分增高可能与高风险组的抗肿瘤反应更为强烈有关。然而B 细胞中的一些调节B 细胞具有抑制表型，可以抑制抗肿瘤反应，并通过产生抗炎细胞因子和抑制分子的表达来支持肿瘤的生长［13］，高风险组中B细胞的增高也可能与此有关。免疫通路中高风险组的评分在Ⅱ型干扰素反应通路、T 细胞共刺激通路上明显高于低风险组。其中，Ⅱ型干扰素能促进免疫抑制、逃避Ⅱ型干扰素依赖的肿瘤免疫监视、介导肿瘤的生长与进展［13］。T 细胞共刺激是由抗原呈递细胞上的共刺激配体与T细胞上的TCR 受体结合而产生，是激活T 细胞的非特异信号［14］。高风险组中肿瘤细胞的生长和转移可能引起更强烈的抗肿瘤免疫，而抗肿瘤免疫所产生的肥大细胞、pDCs、B细胞、T细胞可能与胃癌的预后不良有关。

同时，本文还存在一定的局限性。首先，本研究是基于TCGA 数据库构建并验证，受到了地域、人种、样本数等方面的限制。其次，预后预测模型缺乏前瞻性实验验证。

综上所述，与胃癌预后相关的铁死亡基因为FE2L2、SLC1A5，据此建立胃癌预后预测模型为=e（-0.315×NFE2L2）＋（-0.161×SLC1A5）。该模型对胃癌患者预后的预测价值较高。与胃癌预后相关的铁死亡基因NFE2L2 可能与化学刺激检测、膜电位调节等生物学功能有关，SLC1A5 可能与金属离子传输、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性调节等生物学功能有关。肥大细胞、辅助T 细胞及pDCs 等淋巴细胞，Ⅱ型干扰素反应、T 细胞共刺激免疫通路可能在胃癌的发生发展中发挥重要作用。