环状RNA 功能及其在糖尿病和糖尿病并发症发生发展中的作用研究进展

李珍瑾，周赛君，郭建超

1 天津医科大学第二医院内分泌科，天津300211；2 天津医科大学代谢病医院肾病透析科

糖尿病是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足和（或）胰岛素利用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。根据国际糖尿病联盟2019年统计数据显示，全球约有4.63 亿糖尿病患者，中国糖尿病患者人数排名第一，约为1.164亿人［1］。糖尿病可引起多系统损害，包括眼、肾、神经、心脏、血管等组织器官的慢性进行性病变、功能减退，甚至衰竭，从而危及患者生命。环状RNA（circRNA）是由mRNA 前体（premRNA）反向剪接形成的共价闭合环形RNA 分子，且高度稳定、进化保守，在真核生物中广泛分布。越来越多的证据［2］表明，circRNAs 失调是包括肥胖、高血压和心血管疾病在内的各种代谢紊乱的最初改变之一。研究［3］显示，circRNA 参与心血管系统疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病和肿瘤等多种疾病的发生发展。最近的研究［4］表明，circRNAs在糖尿病及其并发症的发病机制中也起着重要作用。深入研究circRNA 在糖尿病及其并发症中的作用，有助于更好地了解疾病的发生机制，探寻生物学标志物和潜在治疗靶点。现将circRNA 功能及其在糖尿病和糖尿病并发症发生发展中的作用研究进展综述如下。

1 circRNA的功能

circRNA 是一种内源性非编码RNA（ncRNA），由premRNA 反向剪接而成，即将下游5′端剪接位点与上游的3′端剪接位点通过共价键连接形成环状结构，不具有5′端的甲基鸟苷（m7GpppN）帽子结构和3′端的多聚腺苷酸（polyA）尾，不易被核酸外切酶降解，表达也比线性RNA 更加稳定，故在血清外泌体中有成为新型生物学标志物的潜力。circRNA 由不同的序列和域组合而成，可以分为外显子cir⁃cRNA（ecRNA）、内含子circRNA（ciRNA）和外显子-内含子共同组成的circRNA（ElciRNA），以及一些在转运RNA（tRNA）前剪接过程中产生的circRNA（tri⁃cRNA）。与线性RNA 的标准剪切模式不同，cir⁃cRNA 是通过反向剪接环化形成，目前提出了4种模型来阐明其形成机制［5］：①直接反向剪接，又称为内含子配对驱动模型，在pre-mRNA 中两个相邻的内含子通过碱基反向互补配对形成circRNA；②外显子跳跃，即套索驱动模型，外显子跳跃形成套索结构，将切除的套索结构通过反向剪接形成circRNA；③RNA 结合蛋白（RBP）介导的模型，RBPs 可以将两个侧面的内含子连接起来，移除内含子后形成cir⁃cRNA；④内含子环化形成模型，5′端剪接位点富含的鸟嘌呤G、尿嘧啶U 与3′端分支位点的胞嘧啶C核苷酸序列共同构成保守序列，可避免内含子套索结构被降解，从而形成完整的circRNA。由于cir⁃cRNA 序列与同源线性RNA 序列相似，因此如何证明circRNA 的功能目前仍然是一个挑战。随着生物测序技术的发展，circRNA 的一些功能已被探知，其在转录或转录后基因表达调控方面发挥着重要作用。

1.1 通过海绵作用吸附微小RNA（miRNA）来调控mRNA miRNA 是一类具有调控作用的非编码RNA，其能通过与靶mRNA 结合或引起靶mRNA 的降解而影响基因的表达［6］。circRNA 含有miRNA 结合位点，可作为竞争性内源性RNA，通过海绵作用有效吸附miRNA，从而调控miRNA 的靶基因。研究［7］显示，circRNA 小脑变性相关蛋白1 反义转录物（CDR1as）含74 个miRNA7 结合位点，可充当miR⁃NA-7 海绵，调节miRNA-7 靶mRNA 的表达水平；进一步研究发现，CDR1as 不能被RNA 诱导沉默复合物（RISC）降解，而RISC 是由miRNA-7 介导的，可以补充miRNA-671 的降解。然而，并不是所有cir⁃cRNA 都具有海绵吸附调控mRNA 的作用。有研究［8］发现，来自同源域相互作用蛋白激酶3（HIPK3）基因外显子2 的circHIPK3 可作为多种miRNA 的“海绵”。

1.2 与RBPs 相互调控 RBPs 是RNA 转录后调控的关键，参与RNA 的成熟、转运、定向和翻译。越来越多的研究［9］表明，RNA 聚合酶Ⅱ等RBPs 可与cir⁃cRNA 结合，影响circRNA 的剪接、折叠、稳定、加工和定位，circRNA 还可以作为RBP 的“海绵”起到基因表达转录后调节器的作用，例如circRNAs与RISC的Argonaute 蛋白（AGO）相互作用，调节miRNA 起作用。有研究［10］发现，circPABPN1 通过结合RBP 人抗原R（HuR）来阻断HuR 与PABPN1 mRNA 的相互作用，从而导致mRNA 的翻译率低。此外，还有研究［11］表明，在血管平滑肌细胞和巨噬细胞中，INK4基因座（circANRIL）中的环状反义非编码RNA 与pescadillo 同源物1 的c-末端结构域结合，该结构域是一种重要的60S 前核糖体组装因子，从而减弱了核酸外切酶介导的前rRNA 加工和核糖体合成。由此可见，circRNA 与RBPs 的相互调控在调节疾病过程的不同方面的有潜在作用。

1.3 调控基因转录 尽管大部分circRNAs 主要位于细胞质中，但位于细胞核内的ElciRNA 被认为参与了调控基因转录的过程，以促进其亲本基因表达。研究［12］显示，来源于锚蛋白重复结构域52 基因内含子的circRNA（ci-ankrd52）和沉默信息调节因子7 circRNA（ci-sirt-7）能够通过与RNA 聚合酶Ⅱ延伸复合物的相互作用，分别增强其亲本基因ankrin52和RIRT7 的表达。还有研究［13］证实，真核细胞翻译起始因子3J circRNA（ElciEIF3J）和多聚（A）结合蛋白相互作用蛋白2 circRNA（ElciPAIP2）属于外显子-内含子circRNA，可通过与U1 小核核糖核蛋白（sn⁃RNP）结合形成ElciRNA-U1 snRNP 复合体，该复合体结合RNA 聚合酶Ⅱ发挥顺式调控作用，从而促进其基因的转录，而ElciEIF3J 和ElciPAIP2 的大量减少也降低了EIF3J 和PAIP2 的转录水平。此外，cir⁃cRNA 的形成和pre-mRNA 剪接成线性RNA 的过程都需要一个共同的外显子，这两个过程形成竞争，可中断mRNA的剪切调控，影响mRNA的表达。

1.4 参与蛋白质翻译 以往观点认为，circRNA 由于没有5′端帽子和3′端的polyA 尾结构是不能翻译的。而近些年研究［14］显示，一小部分circRNA 具有内部核糖体进入位点（IRESs），可以参与蛋白质翻译，例如与多聚核糖体相关的circZNF609 可以一种非依赖于5′端帽子结构的方式进行翻译。在果蝇的大脑中，有些circRNAs 是可以翻译的，这表明核糖体相关的circRNA 的非翻译区（UTR）允许没有5′端帽子结构也能够进行翻译。N6 甲基腺苷（m6A）RNA 的修饰有效地触发了circRNAs 向蛋白质的转化，m6A 共有基序在circRNAs 中丰富，而单个m6A位点就足以驱动翻译起始。circRNA 能否直接翻译是一个有争议的问题，例如在大肠杆菌细胞中，长度为126 个核苷酸的circRNA 可以有效地转化为蛋白质。最近的研究［15］表明，一些circRNAs 可以在细胞中转化为短肽，尽管有时表达水平较低，但它们仍发挥着关键作用。而从circRNAs 中提取的编码多肽是否具有生理功能尚待研究。

1.5 产生假基因 一项研究［16］表明，circRNA 也可作为反转录的转座子，并且加工后产生的假基因可被插入到宿主基因组，所以来源于circRNA 的假基因使得circRNA 获得一个新功能：通过插入其转录产物来改变基因组DNA 合成。但尽管有这些发现，目前对于假基因的功能和机制仍不清楚。

2 circRNA 在糖尿病和糖尿病并发症发生发展中的作用

2.1 circRNA 在糖尿病发生发展中的作用 cir⁃cRNA 的高度稳定性、特异性和敏感性，以及较低的检测成本，使其可成为糖尿病诊断和预测的潜在生物学标志物［3］。通过微阵列分析2 型糖尿病（T2DM）和健康受试者的外周血circRNA 水平，筛选有差异性表达的circRNA，验证后发现cir⁃cRNA0054633（has_circ_0054633）可作为糖尿病前期和T2DM 的诊断生物学标志物。进一步研究［17］表明，circRNA0054633 通过miRNA-218/环形交叉轴突导向受体同源物1（Robo1）和miRNA-218/血红素加氧酶1（HO-1）通路来调控高糖诱导的血管内皮细胞功能障碍，这可能与糖尿病的发病机制有关。在妊娠期糖尿病（GDM）患者中，circRNA0054633 与母体血样本（包括胎盘组织和脐血）糖化血红蛋白水平高度相关，在妊娠中期、晚期、胎盘及脐血中具有诊断价值，与circRNA-103410 在妊娠晚期和新生儿脐血中有很强的相关性［18］。还有研究［19］发现，circ-5824、circ-3636和circ-395在GDM 中表达下调，可能参与了晚期糖基化终产物受体信号通路。高糖可以诱导与心血管疾病生化特性相关的血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖。CHEN 等［20］发现，通过微阵列分析高糖环境下体外培养人VSMCs 的circRNA 水平，cir⁃cWDR77 是上调最显著的转录物，提示circWDR77可能是糖尿病慢性并发症的生物标志物。

胰岛β 细胞功能受损是T2DM 发病的主要原因，CDR1as作为miRNA-7抑制剂，通过吸附miRNA-7，增强肌球蛋白VⅡA 与Rab 相互作用蛋白（Myrip）和盒蛋白（Pax6）基因表达，促进胰岛β 细胞增殖和胰岛素分泌，从而使胰岛β 细胞功能得到全面改善。事实上，过表达miRNA-7a 的转基因小鼠由于胰岛素分泌受损和胰岛β 细胞去分化而易诱发糖尿病。STOLL 等［21］检 测 糖 尿 病 模型 小 鼠胰 岛β 细胞 中CDRlas 和circHIPK3 的表达均减少，沉默这两种cir⁃cRNA会导致胰岛素分泌缺陷、胰岛β细胞增殖能力降低和存活率下降，这表明circHIPK3 和CDRlas 表达改变可能在糖尿病的发生中起作用。同样，CAO等［22］发现，在糖尿病患者的主动脉内皮细胞（HAECs）和高糖培养的人脐静脉内皮细胞（HU⁃VECs）中，circHIPK3 的表达显著降低。因此，CDR⁃las和circHIPK3可能是糖尿病的潜在治疗靶点。

2.2 circRNA在糖尿病并发症发生发展中的作用

2.2.1 circRNA 在糖尿病心脑血管疾病发生发展中的作用 糖尿病心脑血管疾病是糖尿病患者死亡和致残的首要原因。circRNAs 被证明能影响血糖升高、炎症和脂质积聚，这些都会对血管产生不良影响，并可导致内皮功能障碍和心血管疾病（CVD）的发展。研究［11］显示，circANRIL 与动脉粥样硬化风险降低密切相关。有证据［23］表明，circRNA ZFAS1和CDR1as 表达的变化可以预测急性心肌梗死，has_circRNA11783-2 与T2DM 患者冠状动脉疾病的发生关系密切。还有研究［24］发现，在T2DM 患者外周血细胞中，circANKRD36表达显著上调，并与炎症因子相关，由于血管炎症是糖尿病和CVD 的重叠危险因素，因此circANKRD36 可以作为糖尿病患者炎症性心血管疾病发展的生物学标志物。糖尿病是脑血管疾病的重要危险因素，在急性缺血性脑卒中患者的血浆中circDLGAP4表达下调，与疾病严重程度、炎性细胞因子表达和促炎基因miRNA-143 表达呈负相关［25］。糖尿病性心肌病（DCM）是指发生在糖尿病患者，在没有冠心病、高血压等其他心脏危险因素的情况下，心脏结构和功能发生异常的一种疾病。研究［26］发现，circRNA 与DCM 的发生密切相关。TANG 等［27］发现在糖尿病小鼠心肌中以及血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心肌成纤维细胞中，circRNA-000203 的表达显著增加，这可能成为预防和治疗DCM 心肌纤维化的潜在靶点。有研究［28］发现，cir⁃cRNA-010567 在糖尿病小鼠心肌中表达显著上调，其可通过miRNA-141/转化生长因子β1（TGF-β1）途径 促 进 心 肌 纤 维 化。最 近，YANG 等［29］研 究 证明，hsa_circ_0076631（CACR）在高糖环境下的人心肌细胞和糖尿病患者的血清中高表达，CACR 可通过靶向miRNA-214/caspase-1 通路来介导DCM 细胞凋亡。

2.2.2 circRNA 在糖尿病视网膜病变（DR）发生发展中的作用 DR 是糖尿病微血管的主要并发症之一，且是导致视力下降和失明的主要原因之一，高血糖、高血压、血脂异常和糖尿病病程长是DR 微血管功能障碍的危险因素和主要原因。ZHANG等［30］研究发现，circ_0005015 在DR 患者的血浆、玻璃体和纤维血管膜中表达显著上调，siRNA 介导的circ_0005015 沉默能够显著降低人视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成。SHAN 等［31］研究发现，circHIPK3 在糖尿病视网膜功能障碍中起着重要作用，可作为内源性miRNA-30a-3p海绵促进内皮细胞增殖和血管功能异常，沉默circHIPK3 可以减弱毛细血管渗漏和炎症，从而改善视网膜血管功能障碍。还有研究表明，过表达circZNF609 能够通过增加白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的分泌而促进炎症反应，加重DR 小鼠的血管渗漏和毛细血管变性；circZNF609 沉默可减少视网膜血管丢失、抑制病理性血管生成，以避免高糖和缺氧应激损伤。此外，circRNA-cPWWP2A 能通过抑制miR⁃NA-579 上调相关靶基因血管生成素1、紧密连接蛋白和沉默信息调节因子1（SIRT1）的表达，从而减轻糖尿病引起的视网膜血管功能障碍［32］。

2.2.3 circRNA 在糖尿病肾病（DN）发生发展中的作用 DN是另一种主要的糖尿病微血管并发症，是导致终末期肾病的首要原因。HU 等研究［33］发现，circ_15698 在db/bd 小鼠和高糖诱导的小鼠系膜细胞中表达上调，circ_15698 通过吸附miRNA-185 增加TGF-β1水平，促进细胞外基质（ECM）相关蛋白的合成。CHEN 等［34］研究报道了在高糖条件下上调的circLRP6 通过miRNA-205 来影响系膜细胞的损伤，circLRP6 可调控高糖诱导的增殖、氧化应激、ECM积累和炎症，同时能激活Toll 样受体4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）通路参与DN 的进展。最近研究［35］显示，circ_008045 的表达与DN 的进展呈正相关，在系膜细胞中其可通过miR-24-3p 海绵作用抑制细胞增殖和纤维蛋白产生。

2.2.4 circRNA 在糖尿病神经病变（DNP）发生发展中的作用 DNP 是最常见的糖尿病并发症之一，涉及外周神经和自主神经，影响超过50%的糖尿病患者，包括miRNAs、circRNAs 在内的ncRNAs 均在DNP 的发病机制中起着重要作用。WANG 等研究［36］发现，circHIPK3 在患有糖尿病神经痛的糖尿病患者血清和链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的背根神经节中表达显著增加，鞘内注射circHIPK3shRNA 可以缓解糖尿病大鼠的神经性疼痛，其机制可能是circHIPK3 通过负向调节miRNA-124 的表达发 挥 作 用。LIU 等［37］研 究 了 自 噬 相 关circRNA（ACR）对高糖刺激大鼠雪旺RSC96 细胞（作为DNP的体外模型）的影响，发现ACR 能够通过下调miR⁃NA-145-3p 来减轻RSC96 细胞的凋亡、自噬和氧化应激。

综上所述，circRNAs 可调节胰岛β 细胞的功能参与糖尿病的发生、发展，也可作为糖尿病诊断和预测的潜在生物学标志物，并与糖尿病大血管病变、微血管病变等并发症均有关。将circRNAs与临床、遗传学、表观遗传学和经典标记物结合起来，有助于指导糖尿病患者的医疗决策，尤其是在精确医学方面。由于circRNAs 是一个相对较新的研究领域，circRNAs 的细胞特异性和组织特异性，以及在活检和外泌体中高稳定性，使其有希望成为下一代糖尿病治疗的药物。与其他治疗方法一样，circRNAs 作为药物也可能引起不必要的不良反应、改变药物的敏感性或引起耐药性。在未来几年里，我们对circRNA 调控网络的理解将不断加深，新的生物学角色可能会出现，这将为建立基于circRNA 的治疗方法和促进其发挥作用奠定更坚实的基础。