骨关节炎不同表型动物模型的选择与制作

孙洁，姜萍，陈宗锐

1山东中医药大学，济南250014；2山东中医药大学附属医院

骨关节炎（OA）是一种与遗传、创伤、代谢、应力改变、炎症等多因素相关的关节退行性疾病，好发于中老年人，以关节软骨退变、骨质增生为病理特征，临床表现为关节疼痛、肿胀、僵硬、活动受限等，最终可致关节功能障碍和残疾。随着人口老龄化和肥胖患病率的增加，髋和膝关节OA成为全球第11大致残原因［1］，造成沉重的经济及社会负担。目前OA的治疗仅限于对症，尚缺延缓病情进展的药物，其病理机制及治疗靶点、药物亟待研究。新近研究表明，OA并非是单纯的一种疾病，而是存在着不同表型，表型间存在的差异显著影响预防及治疗的精准性。而OA的慢病性质及人类受试者的个体差异性体现了以人为对象进行实验研究的局限性，因此要深入研究不同表型OA具体病理机制及有效药物治疗方法，需要依据不同表型特点建立合理、稳定的实验动物模型。我们查阅文献发现，目前用于OA研究的动物模型多种多样，但缺乏对于不同表型动物模型的归纳总结、比较分析。本文参考2011年柳叶刀OA分型［2］，对创伤性、代谢性、衰老性、遗传性、疼痛性5种表型OA的动物选择与造模方法利弊进行分析，为OA分型造模的研究提供参考。

1 动物的选择

动物模型应优先选择机能、代谢、结构、疾病特点与人类相似的动物，同时考虑动物护理、成本、可操作性、疾病进展和对特定治疗的反应［3］。

1.1 小型动物 小型动物多用于研究OA发病机制和病理过程，具有更易获取、成本更低、研究周期更短的优势。由于某些药物在小动物模型与人体实验中的效果并不完全相同，小型动物常作为OA治疗干预的第一个筛选模型。

1.1.1 小鼠 基因组测序显示，平均85%的蛋白质编码基因在人类和小鼠高度一致［4］，故基因调控诱导的遗传性OA表型研究多选用小鼠造模，可对其进行基因修饰或培育对OA敏感的品系。小鼠多用于OA分子水平研究，例如促炎细胞因子对OA发展的影响［5］。完成实验所需时间长短取决于动物的骨骼成熟程度，小鼠骨骼成熟周期较短，约为10周［6］，适于短期实验。膝关节在生物力学和解剖结构上与人类有一定相似性，多用于膝骨关节炎（KOA）研究，但其关节腔较小，平均软骨厚度至少比人类小70倍［7］，手术操作及指标取样检测存在难度，因此多用于塑造非手术诱导的OA模型。

1.1.2 大鼠 大鼠关节腔更大、软骨及骨层更厚，手术、灌胃及关节内操作较简便，可诱导部分甚至全层软骨缺损的KOA模型，多用于基因治疗、干细胞移植、人工软骨植入和局部生长因子治疗研究［8］，因其反应灵敏，还可用于疼痛观察及药物反应、KOA与神经系统相关性研究［9］。

1.1.3 豚鼠 豚鼠与人类OA的组织病理学相似度非常高，具有类似的评分体系，且关节内生物标志物软骨寡聚基质蛋白、硫酸角质素易于检测［10］，适用于预防性治疗的研究。另外，豚鼠存在自发性OA，对研究衰老型OA有一定价值。

1.2 中大型动物 中大型动物如兔、犬、猪等，其解剖结构与人类相似，有些动物存在自发性OA，但实验成本较高、周期较长，多用于临床前实验确认药物疗效［7］。

1.2.1 兔 兔的体型较大，易于标本提取及指标观察，尤其适于早期OA研究，软骨未发生缺损情况下即可评估早期OA［11］。兔关节腔较大，利于手术操作，采用前交叉韧带切断法（ACLT）构建的兔OA模型Mankin评分分值较高，是研究OA软骨退变较为理想的模型［12］。但由于兔具有很强的自愈能力，在模拟OA发生及发展进程方面存在一定局限性，且膝关节长期屈曲，在步态及生物力学方面与人类存在差异，关节组织结构和分布也与人类不同，不适合功能性研究。

1.2.2 犬 犬的膝关节结构与人类相似，OA病因、症状与治疗方法亦与人类相似性较高，特别是胃肠道结构及生理机能与人类相似，尤其适合OA肠内疗法的研究［13］。犬的关节腔更大，利于手术操作及组织样本提取，可应用关节镜及MRI检查。但犬作为宠物，用于实验研究仍存在争议，不易通过伦理审查。

1.2.3 羊、猪、马 羊的半月板较大，且OA半月板损伤情况与人类接近，适于OA半月板退变的研究，是ACLT法诱导OA的最佳动物模型［14］，多用于临床前实验。其中山羊膝关节的解剖结构最接近人类，软骨层更厚，适合软骨修复的相关研究。需要注意的是，反刍动物消化系统的特殊性可能对药物实验存在影响。猪软骨层较厚，适于软骨观察研究，马的掌指关节与人膝关节有许多相似之处［7］，但二者成本过高，较少用于OA造模。

2 不同表型OA造模方法

2.1 创伤性OA表型造模方法 创伤性OA主要与机械应力相关，可通过侵入性或非侵入性方式快速诱发。

2.1.1 侵入性诱导法 通过关节腔内侵入性操作迅速诱导OA，但需注意有创操作带来的额外损伤及可能的感染所引起的混淆效应。

ACLT具有操作简单、结构破坏小的优势，是目前最常用的手术造模方法。由于ACLT主要通过打破关节稳定性诱导软骨退变，相较半月板切除（MMT）术诱导的OA病变进程更缓慢，故在药学研究中的易用性更佳。刘振龙等［15］对兔行ACLT并剪断2 mm以防愈合，4周后组织学评分判断软骨损伤处于早期，并指出MANKIN评分与OOCHAS评分均可用于OA评价，而后者可能更适于评价早期OA软骨损伤。此外，低幅高频振动及患肢负重锻炼均可加速ACLT诱导的大鼠OA进程、缩短实验周期［16-17］。

MMT诱导的OA进程较ACLT快，故适于短期研究，大鼠和豚鼠是MMT最常用的动物。张荣凯等［18］切除大鼠膝关节内侧半月板及内侧副韧带造模，4周内改变类似人类早期OA，是研究早期OA的理想模型。

改良Hulth法是在传统Hulth法基础上保留后交叉韧带或内侧副韧带及后交叉韧带的手术造模方法，造模成功率高，是目前常用的造模方法，适于中早期OA研究［19］。方锐等［20］在改良Hulth法基础上强迫兔运动，观察到软骨退变早期代偿性增生至失代偿后软骨细胞和基质减少、软骨变软到剥脱缺失的全过程，与单一改良Hulth法比较，大大缩短了造模周期。

闭合关节刻痕法创伤较小、炎症轻微，被认为是观察早期OA变化，研究软骨保护及修复治疗较为理想的模型。李钊等［21］使用小针刀在股骨髁软骨面、膑软骨及胫骨平台上闭合刻痕，不伤及半月板，术后强迫运动，5周后得到较为理想的OA模型。

2.1.2 非侵入性诱导法 通过体外冲击诱导关节内结构损伤，可避免侵入性操作伴随的感染及并发症，减少误差对实验结果的影响。

关节内胫骨平台骨折法由压头提供冲击力致关节闭合骨折，可调整力度控制病变严重程度，适用于研究急性损伤或骨折后早期OA，不适于研究慢性或低能量冲击损伤OA［22］。

循环关节软骨胫骨压缩法通过向后膝关节施加轴向负荷使胫骨相对于股骨向前位移，是研究慢性过度使用损伤对OA影响的首选模型［14］。有研究发现，使用此法造模5 d后6 N负荷诱导轻度滑膜炎，9 N负荷致前交叉韧带撕裂、重度滑膜炎及异位软骨形成［23］，一段时间的重复压缩后可用于研究软骨下骨变化［24］。

胫骨压缩超载法采用单一机械循环加压诱导膝关节损伤，适用于高能量冲击创伤及早期OA研究。CHRISTIANSEN等［25］使用此法造模，发现1周内骨小梁迅速大量丢失，第4周时快速恢复、关节间隙变窄，8周后显示为轻度OA。

2.2 代谢性OA表型造模方法 代谢性OA主要与机械应力、脂肪因子、高血糖、雌激素、孕酮失衡相关［2］，以饮食诱导的肥胖动物模型及卵巢切除法为主，可用于肥胖、糖尿病、雌激素失衡相关OA研究。

高脂饮食诱导模型不破坏关节结构完整性及稳定性，接近人类肥胖型OA发病机制，在肥胖相关OA中最为常用。BARBOZA等［26］发现，高脂饮食诱导雄性C57BL/6J小鼠发病的时间进程约为20周，导致了明显的肥胖、葡萄糖耐受不良及包括骨赘和软骨潮汐复制在内的早期OA。考虑到四足啮齿类动物与人类运动方式不同所致的负荷差异，SON等［27］在高脂饮食诱导基础上使用跑步机训练小鼠两足行走，建立了更接近肥胖型人类关节负荷的OA模型。

卵巢切除法通过影响雌激素及其类似物生成来诱发OA，适用于绝经、骨质疏松相关的OA研究。HØEGH-ANDERSEN等［28］通过切除卵巢诱导SD大鼠OA，发现代表骨吸收的CTX-Ⅰ及软骨变化的CTX-Ⅱ水平与关节最终退变呈显著相关性。王文胜等［29］在切除双侧卵巢基础上对大鼠进行上坡疲劳性跑台训练，4周后软骨Mankin评分达到损伤标准，较单纯卵巢切除造模法的效率显著提高。

2.3 衰老性OA表型造模方法 衰老性OA与年龄、软骨细胞凋亡等因素有关，目前以自然衰老的自发性OA或敲除抗衰老基因配合手术造模为主。其中具有自发性OA的Hartley豚鼠因组织病理学改变与人类相似度高且生物标志物易于检测而较为常用［30］。于斐等［31］通过敲除抗衰老基因沉默信息调节因子（SIRT1）配合单膝关节ACLT+MMT建立高龄小鼠KOA模型，模拟老年OA，可用于研究年龄相关OA及药物长期治疗的有效性。

2.4 遗传性OA表型造模方法 遗传性OA主要与基因相关。曹斌等［32］筛选总结转基因动物模型文献，发现敲除小鼠Col11a1、Col2a1基因，或Del1、Ⅱ型、Ⅸ型胶原基因突变，或软骨基质基因缺陷，均可诱发OA。此外，铜转运基因缺陷、MMP-13基因过表达、组织特异性BMP-1a型受体缺乏，以及ADAM-15基因、MMP-14基因、IL-6基因、Mig-6基因、A-1整合素基因、纤维调节素和基膜聚糖基因双链、纤维调节素和二聚糖基因单链或双链的敲除亦可导致OA［33］，可用于遗传性OA发病机制及药物疗效研究。

2.5 疼痛性OA表型造模方法 疼痛性OA主要与炎症、骨破坏及异常疼痛相关［2］，可采用关节腔注射法、寒冷刺激法及血液循环阻断法造模。

关节腔注射法通过改变腔内微环境诱导OA，具有造模时间短、操作简便的优势。碘乙酸钠是目前OA关节腔注射最常用的化合物，通过抑制Krebs循环的甘油醛-3-磷酸脱氢酶诱导软骨细胞凋亡，引起软骨基质改变、软骨降解丢失、滑膜炎症等病理改变。POMONIS等［34］报道，碘乙酸钠较木瓜蛋白酶能更好地诱导以疼痛为主症的慢性关节变性，且疼痛、关节退变程度与注射时间、浓度相关，是研究OA疼痛机制、炎症、检测药物疗效的经典方法。木瓜蛋白酶注射诱导的OA病变速度快，可模拟软骨破坏终末阶段。汪宗保等［35］以2%木瓜蛋白酶与0.03 mol/L左旋半胱氨酸的混合液注入大鼠关节腔，注射后4～6周成功诱导早期OA。胶原酶通过分解软骨细胞间基质胶原蛋白诱导OA。刘军等［36］采用关节腔注射胶原酶诱导的KOA类似于老年鼠自发OA，使用Ⅱ或Ⅳ型胶原酶造模3 d后即可观察到OA病理改变。

寒冷刺激血管收缩可致血运不畅，组织缺血缺氧，关节液成分改变，释放炎症因子诱发OA。林强等［37］以石膏将大鼠四肢每日4 h固定于4℃凉水诱导OA，6周后观察到软骨损伤，血清及滑膜中IL-1β、TNF-α、PGE2、COX-2、γ干扰素水平均升高。该造模方法常用于中医阳虚寒凝、寒湿痹阻型OA的实验研究。

血循阻断法通过阻断血流导致骨内高压，关节内静脉回流受阻、动脉灌注不足，软骨组织营养供给不足诱发OA。戴七一等［38］结扎动物臀下静脉、股静脉及大隐静脉，8周后建立了早中期KOA动物模型。此种造模方法亦可用于中医气滞血瘀型OA研究。

OA分型化可提高研究的针对性与准确性，研究者可根据不同表型实验需要，结合动物及造模方法优缺点，选择最适宜的动物用于研究。但目前尚无OA造模公认的操作及评分标准，存在较大的探索空间。