腹泻犊牛大肠埃希菌的分离鉴定及药敏试验分析

李小军/河南省济源市动物卫生监督所 454650

1 大肠埃希菌

大肠埃希菌属于革兰阴性菌，具体形态为两端呈现钝圆的状态，并且没有芽孢存在的，大小上也偏小，并且存在着鞭毛，可以进行运动的，有单独存在的，也有两个一起存在的。肠道的正常菌群的组成部分之一就是非致病性的大肠埃希菌，所以它是没有什么危害的，但是致病性大肠埃希菌则不同，如果感染了这种致病性的大肠埃希菌，轻微的症状可能会出现腹泻，败血症，如果情况较为严重的话就会导致器官衰竭乃至死亡。

致病性的大肠埃希菌主要分为肠产毒素型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、弥散黏附型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌、肠聚集型大肠埃希菌共六种类型，在这些类型中造成犊牛产生腹泻或者是脱水死亡的最主要的病菌类型就是肠产毒素型大肠埃希菌。犊牛的大肠杆菌疾病还叫做犊牛白痢，这种疾病主要是在犊牛出生后的2d 左右会发病，并且死亡率是相当高的，即使痊愈来也会有很多的后遗症出现，有极大的可能性会影响到犊牛的生长发育。一些初期的临床症状主要为排便呈现较稀的黄白色状态，后期可能会夹杂一些血丝，体温呈现不断上升的趋势，如果是相对较为急性的病例的临床表现主要为脱水较为严重，时间长了会出现败血症，严重的可能会出现器官衰竭的情况，可能不到一周就会死亡。通过解剖患病死亡的犊牛，可以看到病牛体内的肠系膜淋巴结是肿的状态，并且小肠的粘膜呈现出一种充血的状态，肝脏以及肾脏相对正常的犊牛来看更加的苍白，通过对这些患病器官进行分离鉴定以及药敏实验，选择适合犊牛使用并且能够达到最好的治疗效果的药物，为治疗腹泻犊牛大肠埃希菌提供有价值的参考。

2 实验材料与实验方法

2.1 实验材料实验材料的来源主要是解剖并取出患病死亡犊牛的内脏器官，用于实验的动物可以选用雄性的小白鼠来进行试验。选择普通肉汤、普通琼脂平板等作为培养基，选择革兰染色液、MR 试剂、明胶溶液等作为主要试剂，还要选择一些实验所需要的药敏片以及试剂盒。仪器上需要高速冷冻离心机、立式压力蒸汽灭菌器、凝胶成像分析系统以及一个电子天平。

2.2 实验方法首先进行病毒检测，检测牛病毒性腹泻病毒、牛腺病毒7 型、牛冠状病毒、牛轮状病毒这四种引起犊牛腹泻的最常见的病毒类型。在犊牛的器官中选取肝与脾进行研磨匀浆离心，再分别按照病毒的DNA 和RNA 分别进行核酸样品的提取。选取一定量的琼脂糖平板凝胶来对 PCR结果进行电泳检测。如果得到的结果呈现出阴性，就可以进行细菌分离鉴定。

进行细菌的分离鉴定前必须要对细菌进行分离培养，将已经准备好的犊牛的肝与脾分别进行划线并且把它们接种在血平板的上面，进行恒温的培养，1d 后在上面寻找一些疑似的菌落，分离在血平板的上面用划线的方法，再进行单独的恒温培养，一定的时间后进行单独的提取，然后进行形态结构以及染色体的特性上的具体观察。

分离出来的菌落要进行培养并且观察，可以接种在普通的肉汤、普通平板和一些其他的平板以及一些琼脂上进行分别的恒温定时培养，到时间后分别观察它们的具体状态。

还要对已经被分离出来的菌落进行生化试验，比如接触酶试验或者是明胶试验等很多种试验方法，可以根据具体的菌落情况进行具体的选择。

对分离出来的菌株也要进行基因序列检测，查看扩增体系以及循环条带，如果接种于琼脂糖凝胶进行了电泳以后呈现出来的基因有阳性的条带，那要进一步进行基因序列检测，并且要将其与基因数据库中的基因进行进一步的比对。

采用纸片扩散法来作为已经分离出来的菌落的药敏试验。

选择一些小鼠随机打乱分组来进行分离菌的致病性试验，向已经分好组的小鼠分别注射已经分离出的等量的不同的菌液，再抽取一组只注射无菌肉汤为对照组，然后对其出现的症状以及死亡率进行观察以及记录。

3 阳性结果判断

3.1 病毒检测对上述的四种常见的会引起腹泻的四种病毒分别进行检测，如果检测的结果是阴性的，说明犊牛腹泻疾病与这四种病毒无关。

3.2 培养分离出的菌落并且观察革兰染色体分别从犊牛的肝脏以及脾脏中分离出一株细菌，再挑取菌落，然后进行革兰染色试验，并观察试验的结果，一般正常情况下观察到的实验结果是革兰染色呈现阴性的杆菌，大小较为中等，两端的形态呈现钝圆形态，单独或者两两排列。

3.3 分离出来的菌落的特性分离出来的菌落在培养基中呈现出浑浊的状态但是在琼脂上的状态却各不相同，例如营养琼脂中状态极好，呈现灰白色的状态，在SS 琼脂上基本上不生长。

3.4 分离出的菌落的生化鉴定分别对分离出的菌落进行生化试验，并且与大肠埃希菌进行了结果以及形态上的比对，试验结果一致，可判定为大肠埃希菌。

3.5 基因检测分别对分离出的菌落进行了DNA 基因检测，并且与大肠埃希菌的基因序列进行比对，序列结果显示一致，所以判定为大肠埃希菌。

3.6 进行药敏试验分别对分离出的菌落进行药敏试验，检测其对抗生素药物的敏感程度。

3.7 对于动物的致病性检测分别采用小鼠作为试验的对象，用于试验的小鼠1d 内的不同时间段均出现临床反应比如精神不振并且颤抖等，最后都死亡。对照组则一切良好。对死亡的小鼠进行解剖观察可以发现其体内的细菌与之前实验所分离出的菌落是一致的。

4 结语

犊牛的腹泻疾病无论是对于养牛场还是对于犊牛自身来说都是非常重要的，能否正确处理解决犊牛身上所发生的由于大肠埃希菌引起的腹泻疾病，决定了犊牛以后的生长发育情况，从而也决定了养牛场能够获得什么样的经济效益。关于大肠埃希菌的问题很多，细节复杂，治疗难度也是一方面的挑战，让犊牛生活在干净舒适的生活环境里也是不可忽视的一方面，从而减少细菌的入侵，严格记录犊牛的身体状况，发现问题迅速进行科学处理，不要拖延使问题扩大，从而影响到牛场的经济利益。本文通过对腹泻犊牛大肠埃希菌的分离鉴定及药敏试验进行了具体分析以及探讨，希望可以为养牛业提供一个参考，为从根本上解决犊牛腹泻疾病问题，并进行一个科学合理的防治，从而来保证养牛业以及与犊牛相关的产业链能够继续保持稳定发展的势头，继续为我国经济发展贡献一部分力量。