茶树籽蛋白质微波辅助酶解制备多肽的研究

郑德勇 陈成聪 颜阳蕾 张洁婷 叶乃兴

(福建农林大学材料工程学院1，福州 350002)(国家茶叶质量安全工程技术研究中心2，泉州 350000)(福建农林大学园艺学院；茶学福建省高校重点实验室3，福州 350002)

中国是茶(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.)的原产地。种植茶树主要为生产茶叶，其副产物茶树籽的产量因品种、树龄、栽培技术等因素而有很大差异[1,2]。据《2017中国茶业年鉴》，2016年全国18个产茶省份茶园面积为290.2万hm2、开采茶园面积220.4万hm2，茶树籽产量十分可观。茶与油茶(CamelliaoleiferaAbel.)同是山茶属(CamelliaL.)的植物，油茶籽油是富含油酸、角鲨烯等功能成分的特种食用木本植物油，我国已有油茶林面积450 万hm2、年产油茶籽油约60万t；茶树籽资源的开发利用刚刚开始，研究表明，不同品种茶树籽含油脂17.77%～38.39%[3,4]，茶树籽油是富含油酸、亚油酸、亚麻酸和二十二碳六烯酸(DHA)的高品质油脂[5]。目前虽有茶树籽油产品面市[6]，但约占茶树籽质量80%的提取残渣未得到有效利用，使茶树籽资源的价值不能充分展现。

生物活性肽大都具有对人体有益的生物学特性，以及易吸收、生物利用度高的优点，是极具发展前景的功能因子[7-10]。有关油茶籽粕提取多肽及其功能活性的研究大量见诸文献[11-18]，茶树籽粕的开发利用也受到关注，学者深入研究了茶树籽淀粉[19-21]、蛋白质[22-24]的提取工艺和酶解产物的抗氧化能力等[25,26]。然而，植物体内游离的多肽物质通常含量很低，目前较为有效的途径是提取蛋白质再经酶解实现批量制备，但酶解时间通常须达数小时，生产效率较低，利用微波辅助酶解技术，可将蛋白质酶解时间缩短至15 min以内[27-30]。以微波为加热源和促酶手段，研究茶树籽蛋白质酶解制备多肽工艺，可为茶树籽粕的高效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

茶树籽采集于福建农林大学实验茶园，风干备用。氢氧化钠、盐酸、硫酸铜、三氟乙酸和茚三酮均为国药集团的AR试剂，胃蛋白酶、络蛋白磷酸肽(CPP)、牛血清蛋白(BAS)为生物试剂。

1.2 茶树籽蛋白质与多肽的制备方法

1.2.1 茶树籽蛋白质的提取

参考陆晨等[31]方法，并改良部分操作。取200 g茶树籽仁破碎，用2 000 mL正己烷分3次浸渍、提取油脂，残渣蒸发溶剂、晾干，得脱脂茶树籽粕，用于茶树籽蛋白质提取。取100 g 脱脂茶树籽粕于2 000 mL烧杯中，加入1 000 mL蒸馏水室温下浸渍6 h，开启搅拌，用10% NaOH溶液调节pH至10.0，在45 ℃水浴中处理80 min，每隔20 min测pH值、并调节至10.0。静置30 min，倾出浸提液，5 000 r/min离心15 min，弃沉淀物；取上清液调节用10% HCl溶液调pH至4.3，在45 ℃水浴中处理80 min，5 000 r/min离心15 min，弃上清液。取出沉淀物，加入蒸馏水洗涤、离心，重复操作4次至溶液呈中性，得到沉淀物。沉淀物冷冻、在冷冻干燥机干燥，得到茶树籽粗蛋白粉。

1.2.2 微波酶解法制备茶树籽多肽

取0.6 g茶树籽粗蛋白粉于100 mL烧瓶中，加入20 mL蒸馏水、搅拌，配制30.0 g/L的茶树籽粗蛋白溶液，加热到 90 ℃、并保持20 min后冷却至室温，备用。按试验设计的条件，用10% HCl溶液调pH，将烧瓶放入超声-微波协同萃取仪中进行处理，微波功率为700 W，酶解结束后迅速加热到90 ℃、保持5 min灭酶，再冷却至室温，水解液6 000 r/min离心20 min，合并上层清液，测定其茶树籽蛋白质水解度和水解液的多肽浓度。

1.3 茶树籽蛋白质微波酶解工艺优化试验方案

1.3.1 微波酶解工艺的单因素试验

采用单因素试验考察胃蛋白酶用量、酶解温度、酶解时间和酶解液pH值等工艺因子对茶树籽蛋白质微波酶解产物的蛋白质水解度和水解液多肽浓度的影响。即：固定条件为蛋白酶用量6 000 u/g、酶解液pH 2.5、酶解时间6 min，酶解温度分别设定为35、40、45、50、55 ℃；固定条件为蛋白酶用量6 000 u/g、酶解温度为45 ℃、酶解时间6 min，分别调节酶解液pH值为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5；固定条件为蛋白酶用量6 000 u/g、酶解温度为45 ℃、酶解液pH2.5，微波酶解时间分别设定为3、6、9、12、15 min；固定条件为pH 2.5、酶解温度45 ℃、酶解时间6 min，胃蛋白酶用量分别为3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 u/g。

1.3.2 微波酶解工艺的优化试验

以胃蛋白酶用量、酶解温度、酶解时间和酶解液pH值为实验因素，选用正交表L16(44)安排工艺优化试验(表1)。以茶树籽蛋白质水解度和产物多肽浓度为指标，分析确定优化工艺条件。

表1 酶解工艺优化正交试验设计表

1.4 茶树籽蛋白质水解度和多肽浓度的测定方法

采用改进的茚三酮比色法[32]测定茶树籽蛋白质的水解度。采用改进的三氯乙酸沉淀双缩脲比色法[33]测定酶解产物茶树籽多肽的浓度。

2 结果与分析

2.1 茶树籽蛋白质微波酶解工艺单因素试验结果分析

2.1.1 胃蛋白酶用量的影响

由图1可知，胃蛋白酶用量对茶树籽蛋白质水解度和产物多肽浓度具有相似的影响，其随胃蛋白酶用量的增加逐渐提高；当胃蛋白酶用量低于6 000 u/g，随着胃蛋白酶用量的增大，茶树籽蛋白水解度和产物多肽浓度均呈近线性快速上升趋势，继续增大胃蛋白酶用量至8 000 u/g，可能由于胃蛋白酶已经达到饱和，其增加值很小。由图1可知，6 000～8 000 u/g是较优胃蛋白酶用量工艺条件。

图1 茶树籽蛋白质水解度和水解液多肽浓度与胃蛋白酶用量的关系

2.1.2 微波酶解温度的影响

由图2可知，微波酶解温度对茶树籽蛋白质水解度和产物多肽浓度具有相似的影响，在35～50 ℃范围内随水解温度的升高、茶树籽蛋白水解度和产物多肽浓度的提高速率较快，并在50 ℃达到最高值；在55 ℃下微波酶解的茶树籽蛋白质水解度和产物多肽浓度均显著降低。这是由于胃蛋白酶对茶树籽蛋白的水解有“最高耐受温度”，高于此温度时、酶的活性受到抑制，而低于这个温度时、酶的活性随温度的升高而提高。

图2 茶树籽蛋白质水解度和水解液多肽浓度与微波酶解温度的关系

2.1.3 微波酶解时间的影响

由图3可知，微波酶解时间对茶树籽蛋白质水解度和产物多肽浓度具有相似的影响，其随酶解时间延长逐渐提高；酶解时间由3 min提高到6 min，茶树籽蛋白水解度和产物多肽浓度提高了近1倍，但在酶解时间达到9 min之后其增长速率减少，可以考虑在酶解工艺优化中将酶解时间的中值设定在12～15 min。

图3 茶树籽蛋白质水解度和水解液多肽浓度与微波酶解时间的关系

2.1.4 酶解液pH的影响

由图4可知，酶解液pH值对茶树籽蛋白质水解度和产物多肽浓度具有相似的影响，由pH 1.5提高到pH 3.5，茶树籽蛋白水解度和产物多肽浓度均呈上升趋势，其中前期上升速率较大、后期速率明显下降，并在pH 3.5达到最高值；当pH大于3.5后，茶树籽蛋白水解度和产物多肽浓度均迅速下降，说明胃蛋白酶在茶树籽蛋白质微波水解体系中的“最适pH”为pH 3.5。这与胃蛋白酶一般最适pH在2.0左右存在明显差异，这可能由于酶解是一个连续变化的过程，酶解液的实际pH值也可能随之变化；也可能由于微波处理极大加快了酶解进程，导致微波环境下胃蛋白酶对pH的敏感性(或最佳pH)发生显著变化；还可能由于茶树籽蛋白质的等电点为pH 3.6[22]，高于pH 4.0时其在水中的溶解度降低，阻碍酶水解进程。

图4 茶树籽蛋白质水解度和水解液多肽浓度与酶解液pH的关系

2.2 茶树籽蛋白质微波酶解工艺优化正交试验结果分析

2.2.1 茶树籽蛋白质水解度工艺优化条件的确定

表2为茶树籽蛋白质微波酶解工艺优化正交试验结果。

表2 茶树籽蛋白质微波酶解工艺优化正交试验结果

由表3可知，影响茶树籽蛋白质水解度的工艺因素主次顺序为D>B>C>A，最优水平分别为A3、B3、C4、D3，即茶树籽蛋白质水解度的实验优化条件为：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解温度50 ℃、酶解时间15 min、酶解液pH值3.5。

表3 茶树籽蛋白质水解度正交试验表

2.2.2 酶解液多肽浓度优化条件的确定

由表4可知，影响酶解液多肽浓度工艺因素的主次顺序为D>B>C>A，最优水平分别为A3、B3、C4、D3，即水解液多肽浓度的实验优化条件为：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解温度50 ℃、酶解时间15 min、酶解pH值3.5。

表4 水解液多肽浓度正交实验K值表

2.3 茶树籽蛋白质微波酶解制备多肽最优工艺条件的确定与验证

综合茶树籽蛋白质水解度和水解液多肽浓度正交实验结果的分析，茶树籽蛋白质微波酶解制备多肽的最优工艺条件确定为：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解温度50 ℃、酶解时间15 min、酶解液pH值3.5。依最优工艺进行重复验证实验，并与水浴加热酶解处理和水浴加热4 h的结果作为对照比较(表5)。

由表5可知，在最优工艺条件下，茶树籽蛋白质微波酶解的产物中蛋白质水解度和水解液多肽浓度分别为13.65%和13.18 g/L，均高于单因素实验和正交实验的最好结果，表明工艺的优化有效。表5的结果也显示，水浴加热酶解4 h的水解度接近微波酶解15 min的效果，说明微波酶解工艺可显著缩短蛋白质酶解进程、提高酶解液中多肽的含量。

微波酶解是茶树籽蛋白质分子中的肽键被酶的催化作用切断、生成分子质量较小的多肽的过程，在适宜条件下，增加胃蛋白酶用量、延长酶解时间，能提高蛋白质的水解度和产物中多肽浓度。根据蛋白质水解度定义，说明在本研究的优化工艺条件下，每个茶树籽蛋白质分子中平均有7.3个肽键发生了降解，产物溶液中多肽的浓度为底物蛋白质浓度(30.0 g/L)的43.93%，取得了较好的效果。在“最佳温度”和“最佳pH值”条件下，进一步增加胃蛋白酶用量会因催化剂饱和问题而效果不显，而延长酶解时间，原理上应该能提高蛋白质的水解度，但同时应注意到多肽也可在此条件下进一步水解为氨基酸，产物溶液的多肽浓度会在达到一个峰值后反而因降解为氨基酸而降低，过度延长酶解时间还会降解生产效率，可见，控制酶解反应时间是必要的。

3 结论

影响茶树籽蛋白质微波辅助酶解制备多肽的蛋白质水解度和酶解液多肽浓度工艺因素的主次顺序均为D>B>C>A，其最优工艺条件确定为：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解温度50 ℃、酶解时间15 min、酶解液pH值3.5。在最优工艺条件下茶树籽微波酶解产物的蛋白质水解度为13.65%、产物的多肽浓度为13.18 g/L。