基于核黄素磷酸钠功能化MoS2纳米片的电化学基因传感器研究

2021-01-09聂思雨韩天成李远卓王先洋

河南化工 2020年12期

聂思雨，韩天成，李远卓，王先洋，张伟

(临沂大学化学化工学院，山东临沂 276000)

起催化作用的磷酸肌醇-3-激酶(PIK3CA)基因是人类癌症中最常见的突变基因之一，在癌症的早期诊断、治疗和预后判断方面具有重要的价值。因此，越来越多的检测PIK3CA基因突变的方法被用来准确预测和诊断癌症[1]。目前，基因突变的检测常用聚合酶链式反应(PCR)这一方法。然而，PCR技术主要有样品处理过程复杂、容易污染以及设备昂贵等缺陷。为了克服上述限制，近年来比色法、拉曼光谱法、荧光、化学发光和电化学法等方法已被用来测定基因突变[2]。在这些技术中，电化学生物传感技术因其能在一定程度上极大地降低信号输出的成本和复杂性，从而得到广泛的应用。

2D层状过渡金属硫族化合物(TMDCs)，化学通式为MX2。TMDCs层间通过范德瓦尔斯力层间生长的。所以，块材TMDCs可以像石墨烯一样，被剥离成单层或者多层的纳米片[3-4]。MoS2是TMDCs家族的典型代表，它是由Mo原子和S原子通过共价键合组成的层状晶体，呈现出“三明治”结构。纳米尺寸的MoS2作为一种层状材料，具有石墨烯类似的结构，更是具备比表面积大、生物相容性好、吸附能力强、易于修饰等特点。凭借上述优异的性能，MoS2纳米片近年来在光电子器件、催化、能量存储等领域都有着广泛的应用，其在生物传感分析方面更是存在着巨大的潜质[5]。

作为维生素B2磷酸化衍生物的核黄素磷酸钠(RFSP)已被用作一种高效分散剂，用于增加石墨烯纳米薄片在水相中的稳定性。在本研究中，由于MoS2纳米片对具有共轭结构的RFSP分子具有良好的物理吸附能力，因此RFSP被作为一种高性能的分散剂和稳定剂，在水介质中稳定地分散MoS2纳米片，通过MoS2纳米片与新型自信号分子RFSP的有效结合构建纳米复合界面，用于核酸杂交的电化学检测。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

RFSP(上海麦克林生化有限公司)；本体MoS2(南京先锋纳米材料科技有限公司)；DNA序列(上海生工生物工程有限公司)。实验中使用的所有试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；玻碳电极(GCE，Φ=3 mm)及其修饰电极为工作电极；饱和甘汞电极为参比电极；铂丝电极为对电极；JEM-2100型透射电子显微镜(日本JEOL)。

1.2 修饰电极的制备

将10 mg本体MoS2加入10 mL浓度为1.0 g/L的RFSP水溶液中，然后超声处理10 h。将获得的悬浮液以12 000 r/min的速度离心处理30 min，循环操作两次后，沉淀物被重新分散到超纯水中，得到的RFSP/MoS2水分散液的浓度为1.0 g/L。将上述制备的RFSP/MoS2分散液滴涂在裸GCE表面上，室温下风干得到RFSP/MoS2/GCE。

1.3 DNA的固定和杂交

将制备的RFSP/MoS2/GCE浸入含有1.0×10-10mol/L ssDNA探针的0.3 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH值=7.0)中2 h，得到ssDNA/RFSP/MoS2/GCE。将含有互补DNA的杂交液(PBS，pH值=7.0)滴在ssDNA/RFSP/MoS2/GCE表面，进行探针ssDNA与互补靶DNA的杂交。此外，ssDNA探针电极与非互补DNA、碱基错配DNA的杂交也通过类似的步骤进行。

1.4 电化学测量

循环伏安(CV)实验在浓度为0.3 mol/L PBS(pH值=7.0)中进行，扫描速率为100 mV/s，电位扫描范围为-1.0～-0.4 V。微分脉冲伏安(DPV)实验也在0.3 mol/L PBS(pH值7.0)中进行，电位范围从-0.95～-0.55 V，脉冲幅度为0.05 V，脉冲周期是0.2 s，脉冲宽度为0.06 s。

2 结果与讨论

2.1 复合材料的透射电镜表征

图1为制备的RFSP/MoS2纳米复合材料的透射电镜图(TEM)。

图1 RFSP/MoS2的透射电镜图

从图1可以看出，RFSP/MoS2纳米复合材料呈现出褶皱的片状结构，没有明显的结块。这表明RFSP是一种高性能的分散剂和稳定剂，结合MoS2基面对具有芳香共轭结构的RFSP的物理吸附作用，可以将MoS2纳米片稳定地分散在水中。

2.2 不同修饰电极的电化学行为

在0.3 mol/L PBS(pH值=7.0)溶液中，采用CV研究不同修饰电极的电化学特性，其结果如图2所示。

a.裸GCE b.MoS2/GCE

在裸GCE(曲线a)和MoS2/GCE(曲线b)处没有观察到阳极峰或阴极峰。但是，在RFSP/GCE(曲线c)处可以看到与RFSP的自身氧化还原反应相对应的一对氧化还原峰。由于MoS2纳米片具有大的比表面积，从而可以明显加速电子在RFSP和电极之间的传输，所以RFSP/MoS2/GCE(曲线d)的CV峰电流响应比RFSP/GCE(曲线c)的CV响应大得多。此外，以上结果表明RFSP通过物理吸附已经被结合在MoS2纳米片表面。

2.3 DNA固定和杂交的电化学表征

利用RFSP在0.3 mol/L PBS溶液中的自身氧化还原信号来监测探针在RFSP/MoS2纳米复合材料上的固定和杂交情况，结果如图3所示。

a.RFSP/MoS2/GCE b.ssDNA/RFSP/MoS2/GCE

由于探针ssDNA的柔性结构特征，可能会改变构象并阻碍电子传导，所以当ssDNA探针通过其碱基与具有共轭结构的RFSP/MoS2纳米复合材料之间的π-π相互作用固定在纳米复合界面上后，如曲线b所示，其氧化还原信号明显降低。探针ssDNA与互补DNA杂交后，由于核酸碱基被包埋，形成的dsDNA从共轭纳米复合物的表面脱落，其自信号(曲线c)较曲线b相比明显增加。总之，RFSP分子的自信号变化可以直接来指示DNA的固定和杂交，不用引入任何外来的指示剂。

2.4 不同基因序列的选择性识别

在0.3 mol/L PBS溶液中，通过探针修饰电极与PIK3CA基因相关的不同序列之间的杂交，研究了该生物传感器的选择性，结果如图4所示。

曲线a为ssDNA/RFSP/MoS2/GCE的DPV响应，当探针ssDNA与互补DNA杂交后，dsDNA/RFSP/MoS2/GCE(曲线e)的DPV响应显著增加。ssDNA电极与非互补DNA杂交后的变化不明显(曲线b)，表明几乎没有杂交。当探针与单碱基错配DNA(曲线d)和三碱基错配DNA(曲线c)杂交时，其DPV信号与曲线e有明显区别。以上结果表明，构建的识别界面展现出良好的选择性，可以区分不同的基因序列。