栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠自噬及PINK1/Parkin通路作用研究❋

李 想，张华敏，崔海峰，隋 宇，李盈盈，唐丹丽△

(1. 云南中医药大学，昆明 650500； 2. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700；3. 中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

急性心肌梗死是冠状动脉粥样硬化性心脏病的危急重症，是导致人类死亡的主要病因之一。临床常用经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉旁路移植术等方法对急性心肌梗死进行再灌注治疗，目的是使梗死区域及时恢复血供，但在血流恢复的同时也会加重心肌的损伤，即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MI/RI)[1]。目前MI/RI相关研究虽取得了一定进展，但其机制仍不完全明确。近年来研究发现[2]，线粒体自噬参与心力衰竭、冠状动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管疾病的发生发展过程, 已经成为防治MI/RI的潜在治疗靶点。PTEN诱导假定激酶 (Pink)1/Parkin通路是线粒体自噬依赖的重要通路，在调控缺血再灌注损伤的过程中发挥着重要作用。

栝楼薤白半夏汤出自汉·张仲景所著之《金匮要略》[3]，原书中记载：“胸痹不得卧，心痛彻背者，栝楼薤白半夏汤主之。”课题组前期研究显示[4-5], 该方具有抑制MI/RI时核转录因子-κB(NF-кB)信号通路活化、减轻炎症损伤的作用，能抑制自噬、改善心肌细胞凋亡。本研究拟通过建立MI/RI模型，从PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬的角度观察栝楼薤白半夏汤对MI/RI心肌组织的作用, 以进一步阐明该方对MI/RI大鼠心肌的保护作用机制。

1 材料

1.1 动物

雄性SPF级SD大鼠60只，体质量(200±10) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK-(京)2016-0006。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物室，实验动物室内灭菌水及普通饲料由动物自由摄取，饲养环境为温度20±2 ℃，湿度(55±5)%。本实验已通过中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物伦理委员会审查。

1.2 药物

栝楼薤白半夏汤组成:栝楼24 g，薤白9 g，半夏12 g，黄酒4 L，所有药材购自北京同仁堂饮片有限责任公司，药物剂量按70 kg成人每日1 剂原方用量换算出大鼠每日用量，浓缩成含生药1.3 g/ml的水煎液。自噬抑制剂：3-MA(3-Methyladenine,3-甲基腺嘌呤)购自Sigma公司(货号M9281)。

1.3 主要试剂及仪器

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司(190951、190751)；Cell Signaling Technology(CST)公司抗体：自噬相关蛋白Beclin-1(lot:3)、选择性自噬接头蛋白P62(lot:6)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶，lot:10)和二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋G(IgG)抗体(lot:26)；Abcam公司抗体：Pink1(lot:GR3217577-5)、Parkin(lot:GR3186724-4)和Mfn2抗体(lot:GR211794-1)；电泳仪(BIO-RAD公司)；日立H-7650透射电镜；酶标仪(SynrgyH1)；离心机(5810R、mikro 200R)；Bio-Rad ChemiDoc成像系统；动物呼吸机ALC-V8(上海奥尔科特公司);多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂); 全自动生化分析仪(日本HITACHI公司)。

2 方法

2.1 动物分组与给药

将60只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、MI/RI模型组、3-MA抑制剂组、栝楼薤白半夏汤高剂量组、低剂量组，各组动物常规饲养，条件相同。栝楼薤白半夏汤高剂量组按1 ml/100 g(浓度为13 g/kg)，每日灌服对应汤剂。栝楼薤白半夏汤低剂量组给药量为高剂量浓度稀释1倍后按相同剂量给药，其余各组大鼠每日按1 ml/100 g灌服生理盐水，造模前连续给药3周。

2.2 动物模型复制

大鼠术前24 h进行最后1次灌胃给药，并禁食不禁水。腹腔注射20%乌拉坦进行麻醉(按0.5 ml/100 g)后仰卧位固定四肢及头部，记录Ⅱ导联心电图。颈部、胸前手术野备皮，切开气管连接动物呼吸机(呼吸频率80次/min，吸呼比1∶2，潮气量8 ml/kg)。自左侧第3～4肋间剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，打开胸腔撕开心包膜，于左心耳与肺动脉圆锥之间找出冠状动脉左前降支，并以6-0号缝合线结扎分支起点外约2 mm处(在丝线与心肌间放一根小棉线)，此时缺血心肌壁呈现发绀、膨出，同时记录心电图。Ⅱ导联示ST段弓背上抬，T波高耸，显示心肌缺血形成。结扎30 min后松开，使缺血冠脉再灌注，关闭胸腔再灌注120 min，心电图示ST段回落1/2以上，提示造模成功。结扎前心电图不正常或未到观察终点死亡以及造模不成功者剔除。假手术组在开胸后不结扎冠脉, 而仅在相应部位用针空穿1次即可。3-MA干预组于再灌注前10 min尾静脉注射给药(按20 mg/kg)。

2.3 标本采集及检测

2.3.1 标本采集 动物模型复制结束后取腹主动脉血，之后迅速剪取心脏，用预冷的生理盐水冲洗，在冰盘上切取左冠状动脉供血区的心肌组织和心尖。

2.3.2 血清LDH、CK-MB检测 取出的腹主动脉血在室温下静置30 min，以3000 r/min离心10 min分离血清，按试剂盒说明利用全自动生化分析仪进行检测。

2.3.3 心肌组织病理形态学观察 将大鼠心尖部心肌组织用3% 戊二醛4 ℃固定4 h以上，再以1%四氧化锇4 ℃固定1.5 h后常规脱水，环氧树脂包埋，制作超薄切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜下观察心肌超微结构。

2.3.4 Western Blot法测定心肌组织Beclin-1、P62、Mfn2、Pink1、Parkin蛋白的表达 取大鼠心肌组织标本约50 mg用玻璃匀浆器充分研磨，并加入RIPA裂解液，离心后取上清液用BCA法测定蛋白浓度，于-80 ℃保存。各组按相同总蛋白浓度进行上样，进行10%SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜上，按抗体说明书的推荐方法，用5%脱脂奶粉或5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1.5 h后，加入1×TBST稀释的相应抗体，4 ℃冰箱中孵育过夜，次日取出用1×TBST洗涤，10 min×4次。然后加入二抗，室温下孵育1.5 h后用1×TBST洗涤，10 min×4次。加入显影液用Bio-Rad ChemiDoc成像系统显影，Image Lab 6.0软件进行图像分析，以GAPDH作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 心肌超微结构观察

图1示，假手术组大鼠心肌肌丝形态完整致密排列，线粒体结构正常，无肿胀，排列较好，嵴突结构正常。MI/RI模型组大鼠心肌肌丝断裂或疏松，心肌组织线粒体肿胀变大内部结构疏松或空泡化，心肌组织和线粒体内均有自噬体形成。与模型组比较，3-MA抑制剂组、栝楼薤白半夏汤高、低剂量组大鼠心肌肌丝虽有断裂或疏松，但较模型组程度轻；心肌组织线粒体也肿胀变大，但形态相对完好，嵴突疏松程度较模型组轻。

图1 各组大鼠心肌超微结构电镜图(×30000)

3.2 栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清LDH、CK-MB表达的影响

表1示，与假手术组比较，模型组LDH、CK-MB含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，3-MA组、栝楼薤白半夏汤高、低剂量组LDH、CK-MB含量下降(P<0.01或P<0.05)，抑制剂及各中药干预组之间比较差异无统计学意义(均为P>0.05)。

表1 各组大鼠血清LDH、CK-MB表达比较

3.3 栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌Beclin-1、P62蛋白表达的影响

表2图2示，与假手术组比较,模型组心肌Beclin-1、P62蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，3-MA组、栝楼薤白半夏汤高、低剂量组心肌Beclin-1、P62蛋白表达下降(P<0.01或P<0.05)。抑制剂及各中药干预组之间比较差异无统计学意义(均为P>0.05)。

图2 Beclin-1、P62蛋白表达示例图

表2 心肌组织Beclin-1、P62蛋白表达比较

3.4 栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌Mfn2、Pink1及Parkin蛋白表达的影响

表3图3示，与假手术组比较，模型组心肌Pink1及Parkin蛋白表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，3-MA组、栝楼薤白半夏汤高、低剂量组Pink1、Parkin蛋白表达降低(除高剂量组Parkin蛋白外P<0.05)。与假手术组比较，模型组心肌Mfn2蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，3-MA组、栝楼薤白半夏汤高、低剂量组心肌Mfn2蛋白表达升高(P<0.01或P<0.05)。抑制剂及各中药干预组之间比较差异无统计学意义(均为P>0.05)。

表3 心肌组织Mfn2、Pink1、Parkin蛋白表达

图3 Mfn2、Pink1及Parkin蛋白表达示例图

4 讨论

心肌细胞的正常结构是维持其功能的形态学基础，而心肌细胞超微结构的改变是反映细胞损伤程度最直观的指标。本研究电镜观察表明，MI/RI模型组大鼠心肌组织的肌丝断裂或疏松，心肌组织线粒体肿胀变大，内部结构疏松或空泡化或膜破裂，心肌组织和线粒体内均有自噬体形成，可见线粒体损伤且结构明显破坏。各药物干预组的心肌组织结构形态明显优于模型组，自噬体较少，说明栝楼薤白半夏汤可减轻MI/RI心肌组织及线粒体损伤。

CK-MB、LDH等指标可以用作评价心肌梗死严重程度，其中CK-MB是心肌梗死的一个敏感而重要的诊断指标[6-7]，可用于估计梗死面积的大小，它在心肌组织中含量丰富，而在其他组织中几乎不存在，在血清中的含量越高说明梗死面积越大。本实验显示，MI/RI模型组大鼠血清CK-MB和LDH的含量较假手术组显著增加，提示MI/RI后心肌组织受损。各药物干预组大鼠血清CK-MB、LDH含量较MI/RI模型组均显著下降，说明药物干预可降低心肌酶的释放，减轻心肌组织的损伤，提示栝楼薤白半夏汤对MI/RI心肌具有保护作用。

自噬是细胞内的物质被自身溶酶体降解的过程，是细胞的一种自我保护机制。研究显示[8-9]，MI/RI过程中自噬的激活可能导致心肌进一步损伤，过度的自噬会加重再灌注期的组织损伤，对心脏的功能结构造成不良影响。Beclin-1介导的自噬是一个经典自噬途径，在MI/RI时心肌组织Beclin-1表达增加表明自噬和细胞损伤正在进行[10]。P62也是自噬相关蛋白之一，研究表明[11-12]，在MI/RI时心肌组织的P62蛋白表达增加，表明自噬通量受损，自噬体大量积聚导致细胞损伤甚至死亡。在本实验中，MI/RI模型组大鼠心肌Beclin-1表达较假手术组显著增加，提示MI/RI后发生自噬反应，P62表达增加说明自噬反应已经超过自适应限度即发生了过度自噬。过度自噬造成自噬体的大量积累并进一步对心肌组织造成严重损伤。各药物干预组的Beclin-1和P62表达较MI/RI模型组显著下降，说明栝楼薤白半夏汤能抑制自噬过表达，起到保护心肌、减轻MI/RI的作用。

另有研究显示[13-14]，上调P62蛋白表达可以加快线粒体分裂，促进线粒体自噬。在线粒体自噬时，由于线粒体外膜上的Pink1降解被抑制而招募胞浆内Parkin转位至线粒体, 促进线粒体基质蛋白泛素化, 并募集P62到线粒体基质, P62作为信号接头蛋白进一步介导线粒体自噬与溶酶体结合并促进线粒体降解[15]。同时，Pink1还通过磷酸化消耗Mfn2并促进parkin介导的泛素化，参与线粒体自噬，该过程即为Pink1/Parkin介导的线粒体自噬[16]。实验结果显示，与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠心肌组织P62、Pink1、Parkin蛋白表达显著升高，而Mfn2蛋白表达显著下降，各药物干预组可抑制P62、Pink1、Parkin蛋白高表达并上调Mfn2蛋白水平，提示MI/RI能够激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径，从而引发心肌过度线粒体自噬等系列损伤反应。栝楼薤白半夏汤可通过调控PINK1/Parkin通路，减轻线粒体自噬起到保护再灌注后心肌损伤的作用。

综上所述，栝楼薤白半夏汤对MI/RI大鼠有心肌保护作用，其机制与减少血清心肌酶释放，减轻心肌线粒体结构损伤，抑制Pink1/Parkin通路激活及心肌过度自噬有关。