石房蛤毒素胶体金快速检测试纸卡的应用研究

黄奕雯

(福建省渔业资源监测中心，福建 福州 350003)

赤潮是由于受环境气候影响，水域中的浮游植物、原生生物、细菌等暴发性增殖或聚集而引起水体变异样的一种有害生态异常现象[1]。其不仅会使鱼类、贝类等因呼吸困难而死亡，同时有毒赤潮藻的毒素会在贝类等海洋生物体内积累并向食物链上层传递[2]，从而对人类生命健康产生危害。随着社会经济的快速发展，我国近岸海域水体富营养化程度日趋严重，加上特殊的海湾环境和气候条件，近年来有毒有害赤潮不断发生，严重威胁到渔业生产安全和民众身体健康。

麻痹性贝毒(Paralytic shellfish poisoning，PSP)是迄今为止世界范围内分布最广、危害最大的一类赤潮生物毒素，已成为当前海洋科学的研究热点，受到广泛关注。麻痹性贝毒与河豚毒素作用机理类似，是一种钠离子(Na+)通道阻滞剂[3]，主要通过阻断Na+内流来抑制细胞动作电位的传导，最终导致神经系统传输障碍而产生麻痹作用。中毒表现为食用后0.5 h至3.0 h内引起嘴、唇、舌麻木或有刺痛感，产生头痛、晕眩、恶心、呕吐、腹泻等症状，严重者肌肉麻痹、四肢抽搐、呼吸困难，甚至窒息而亡[4-5]。麻痹性贝毒是一类四氢嘌呤的三环化合物[6]，化学结构如图1所示，是由石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)及其天然衍生物组成的胍类毒素，易溶于水，在酸性条件下耐热[7]。目前已发现的麻痹性贝类毒素有二十几种，根据R4取代基团的差异，可以将其分为四类：氨基甲酸酯类毒素(Carbamate toxins)的R4基团为“-COONH2”，包括石房蛤毒素、新石房蛤毒素、膝沟藻毒素1～4等；N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)的R4基团为“-COONHSO3”，包括膝沟藻毒素5～6等；脱氨甲酰基类毒素(Decarbamoyl toxins)的R4基团为“-OH”，包括脱氨甲酰基石房蛤毒素、脱氨甲酰基新石房蛤毒素等；脱氧脱氨甲酰基类毒素(Deoxydecarbamoyl toxins)的R4基团为“-H”，包括脱氧脱氨甲酰基石房蛤毒素、脱氧脱氨甲酰基膝沟藻毒素2～3等[8-9]。其中石房蛤毒素占麻痹性贝毒的85%以上，是主要毒素[10]。我国及国际上多数国家都以石房蛤毒素为贝类产品中麻痹性贝毒的检测指标，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)均规定贝类中PSP的限量标准为80 μg STX/100 g[11-12]，即以800 μg/kg STX含量为限量标准。

目前，我国麻痹性贝毒的检测方法主要有小鼠生物法、酶联免疫吸附法(ELISA)、液相色谱法(LC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[13]。这些常规检测方法主要依托实验室建立，对仪器设备、实验耗材、环境条件和操作技能等都有较高的要求，需由专业技术人员开展相关检测，并且大多检测周期较长、价格昂贵，当样品量大或遇到赤潮应急监测时，其检测效率则难以满足实际工作的需求。因此，建立简便实用、快速有效、容易推广的贝类毒素检测方法显得尤为重要。胶体金快速检测技术是20世纪90年代初出现的新兴免疫层析检测技术，其利用抗原-抗体特异性结合的免疫反应和层析反应原理，以干片法试纸的形式，将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，用胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，应用微孔膜的毛细血管作用，通过抗原-抗体结合及胶体金显色反应来检测目标物质。该方法具有操作便捷、成本低廉、结果判断简单、适合于现场检测等优点。本研究对一种石房蛤毒素胶体金快速检测试纸卡进行了实际应用测试，旨在为提高贝毒检测效率、赤潮期间贝类质量安全风险防控能力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试牡蛎、缢蛏、花蛤等贝类样品采集于福建沿海地区，储存于-20℃低温冰箱待测。石房蛤毒素(STX)标准品购自台湾藻研有限公司(Taiwan Algal Science Inc)，1 mg/瓶。石房蛤毒素胶体金快速检测试纸卡由福建省水产研究所研制，配有提取缓冲液浓缩片剂、50 mL离心管和一次性塑料滴管。

1.2 仪器与设备

均质器；电子天平(精度0.1 g)；小型电磁炉；计时器。

1.3 样品处理与制备

将贝类样品的外壳用清水彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用蒸馏水淋洗内部去除泥沙等杂质，小心取出贝肉，切勿割破贝体，不得以加热或药物方式开壳。收集约200 g去壳贝肉沥水5 min(应避免贝肉堆积)，捡出碎壳等杂物，将贝肉均质备用。

1.4 胶体金快速检测方法

1.4.1 检测步骤

取缓冲液片剂5片，用纯水配制成500 mL的溶液(可用矿泉水瓶配制)。称取5 g均质后的贝类样品于50 mL离心管中，加入20 mL上述溶液，稍加振荡后沸水浴提取10 min，冷却至室温，待检。如未立即检测，可将提取液冷藏保存，长期保存应于-20℃冷冻提取液。使用前应将待检提取液恢复至室温。

从原包装铝箔袋中取出胶体金快检试纸卡和一次性滴管，置于水平清洁的桌面上。用一次性滴管吸取待检样本，垂直滴加4滴于加样孔中，加样后开始计时，3～5 min内读取结果。如滴加4滴样本后，判读窗口仍无红色层析峰出现，补加1滴样本，并重新开始计时。肉眼观察样品检测结果。

1.4.2 结果判定

石房蛤毒素胶体金快检试纸卡结果判定示意图如图2所示。

阳性：仅质控区(C)有一条粉红色带出现，检测区(T)无色带出现。表明样品中石房蛤毒素含量大于检测限。判读时间若超过10 min，阳性样品的T区可能会出现非常浅的色带，也判定为阳性。

阴性：质控区(C)和检测区(T)都有明显的粉红色带出现。表明样品中不含有石房蛤毒素或含量小于检测限。

无效：质控区(C)没有色带出现。表明操作过程不正确或试纸卡已失效，应更换试纸卡重新测定。

注： C.质控区；T.检测区。

1.5 液相色谱-串联质谱法

按照GB 5009.213—2016《食品安全国家标准 贝类中麻痹性贝类毒素的测定》中的LC-MS/MS法进行样品提取和净化。

液相色谱条件：色谱柱为Atlantis Hilic Silica色谱柱，50.0 mm×2.1 mm，粒径3.0 μm；流动相：A为0.1%HCOOH，B为CH3CN，梯度洗脱条件见表1；流速：0.30 mL/min；柱温：30℃；进样量：2.0 μL。

质谱条件：离子源为ESI源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应离子监测，优化参数见表2。

使用基质加标制作标准曲线，将基质匹配的不同浓度工作液分别注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液中石房蛤毒素的质量浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线进行定量测定。该方法的定量限为100.0 μg/kg。

表1 流动相梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution conditions of mobile phase

表2 多反应监测优化参数Tab.2 Optimization parameters of multi-reaction monitoring

1.6 试纸卡应用测试

1.6.1 添标样品的制备

1 mg/mL石房蛤毒素储备液：取石房蛤毒素标准品1 mg，加入1 mL 0.01 mol/L的PBS缓冲液溶解，于4 ℃保存。

10 μg/mL石房蛤毒素工作液：取1 mg/mL石房蛤毒素储备液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用去离子水定容至刻度，临用前配制。

250 μg/kg添标样品：取10 μg/mL石房蛤毒素工作液125 μL加入5 g阴性贝类样品中混匀。

500 μg/kg添标样品：取10 μg/mL石房蛤毒素工作液250 μL加入5 g阴性贝类样品中混匀。

1 000 μg/kg添标样品：取10 μg/mL石房蛤毒素工作液500 μL加入5 g阴性贝类样品中混匀。

1.6.2 检测限测定

取经LC-MS/MS法确证为阴性的牡蛎、缢蛏和花蛤样品，分别制备石房蛤毒素添标浓度为0、250、500和1 000 μg/kg的样品各10个，按照1.4胶体金快速检测方法进行检测和判定。

1.6.3 假阳性率和假阴性率测定

取经LC-MS/MS法确证为阴性的牡蛎、缢蛏和花蛤样品，分别制备10个石房蛤毒素添标浓度小于或等于250 μg/kg的贝类样品(其中6个添标浓度为0 μg/kg，4个添标浓度为250 μg/kg)和10个石房蛤毒素添标浓度大于或等于500 μg/kg的贝类样品(其中6个添标浓度为500 μg/kg，4个添标浓度为1 000 μg/kg)，按照1.4胶体金快速检测方法进行检测和判定。同时分别以石房蛤毒素添标浓度为0和500 μg/kg的贝类样品作为试纸卡阴性和阳性对照，计算假阳性率和假阴性率。

1.6.4 实际样品检测

取牡蛎、贻贝、缢蛏、花蛤等贝类样品30个，同时按1.4胶体金快速检测方法和LC-MS/MS法进行检测，比较检测结果。

2 结果与分析

2.1 试纸卡的检测限

用试纸卡分别检测石房蛤毒素添标浓度为0、250、500和1 000 μg/kg的牡蛎样品，结果见图3。石房蛤毒素添标浓度为0和250 μg/kg的样品，C线和T线均可见，结果均为阴性；石房蛤毒素添标浓度为500和1 000 μg/kg的样品，C线均可见，T线均无显色，结果均为阳性。因此可确定该胶体金快速检测试纸卡对贝类样品中石房蛤毒素的检测限为500 μg/kg。

对于牡蛎、缢蛏、花蛤等3种贝类样品，当石房蛤毒素含量低于250 μg/kg时阳性检出率为0%；当石房蛤毒素含量高于500 μg/kg时阳性检出率为100%，试纸卡对添加不同浓度石房蛤毒素的样品的检测结果均一致，说明该试纸卡在贝类产品中具有普遍适用性。

2.2 假阳性率和假阴性率

用试纸卡对石房蛤毒素添标浓度小于或等于250 μg/kg的贝类样品进行检测，10个牡蛎、10个缢蛏和10个花蛤样品的检测结果均为阴性，故试纸卡的假阳性率为0%。

用试纸卡对石房蛤毒素添标浓度大于或等于500 μg/kg的贝类样品进行检测，10个牡蛎、10个缢蛏和10个花蛤样品的检测结果均为阳性，故试纸卡的假阴性率为0%。

2.3 实际应用结果分析

分别用试纸卡和LC-MS/MS法检测30个贝类实际样品中的石房蛤毒素，其中牡蛎10个、贻贝12个、缢蛏4个、花蛤4个，结果见表3。用LC-MS/MS法检测时，各基质标准曲线的线性回归方程相关系数均大于0.99，具有良好的线性关系。

检测结果显示，30个贝类样品经LC-MS/MS法检测，有13个未检出石房蛤毒素，17个检出石房蛤毒素，其中10个样品中石房蛤毒素含量小于500 μg/kg，7个样品中石房蛤毒素含量大于500 μg/kg。30个贝类样品经试纸卡检测，23个样品检测结果为阴性，均为石房蛤毒素含量小于500 μg/kg的样品；7个样品检测结果为阳性，均为石房蛤毒素含量大于500 μg/kg的样品，表明两种检测方法结果一致。

实际样品检测结果表明，石房蛤毒素胶体金快速检测试纸卡能检测出石房蛤毒素大于500 μg/kg的贝类样品，且快速简便、稳定可靠，适用于贝类样品中石房蛤毒素的现场快检，可以应用于日常石房蛤毒素检测筛查工作。

表3 试纸卡与LC-MS/MS法检测贝类样品结果比较Tab.3 Comparison of the results of test strip and LC-MS/MS method in the detection of shellfish samples

3 讨论

近年来，我国环境污染日趋严重，正常生态平衡遭到破坏，沿海海域频繁发生赤潮，给渔业生产和百姓健康造成了严重影响，麻痹性贝毒在我国沿海蔓延的潜在危险不容忽视。据统计，全球每年因误食受麻痹性贝毒污染的贝类产品而引发的中毒事件高达2 000余起，死亡率达15%。我国是贝类养殖大国，牡蛎、贻贝、扇贝、蛤、蛏等养殖贝类产品是我国水产品出口创汇的重要品种。欧盟和美国是世界上主要的贝类消费地区，也是我国贝类产品的主要出口国，他们都非常重视贝类安全卫生的源头管理，强调贝类养殖环境的监测与监控。为推动贝类养殖业持续健康发展，保障赤潮期间贝类质量安全，促进贝类产品出口贸易，建立有效的贝毒快速检测方法，对养殖贝类进行风险监控是十分必要的。

当前麻痹性贝毒的检测方法可分为生物测定分析法、仪器分析法、免疫测定法和细胞毒性测定法等四类。小白鼠生物测定法是美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)认证的检测PSP的标准生物技术方法，同时也是国际海产品贸易中的官方方法，目前包括我国在内，世界上约有81%的国家使用该方法检测PSP[14-15]。虽然小白鼠生物测定法在概括样品毒性方面非常有效，但小鼠间的个体差异会导致检测结果准确性不足，且实验耗材和前期准备工作量都较大。高效液相色谱法(HPLC)是较早被应用的仪器分析方法之一，与生物测定法相比，其更加准确高效，专一性强、灵敏度高[16]；但检测耗时较长，需要配备昂贵的仪器，且对操作人员的技术要求高，在基层应用推广中难以普及。酶联免疫技术使用了抗原-抗体结合的原理，灵敏度高，检测时间相对短，适合快速检测筛查样品；但制备多克隆抗体时需大量纯化标准品，检测成本较高[17]。细胞毒性试验是利用藜芦碱激活神经细胞的Na+通道，使Na+内流，从而导致细胞内外离子失调，引起神经细胞死亡，而PSP是Na+通道阻滞剂，因此可通过对比计算细胞死亡率来测定PSP毒性[18]；但由于检测周期长，操作繁琐，需要培养较多细胞，所以该方法尚未在我国建立应用。随着麻痹性贝毒检测实际应用需求的不断增长，更加高效快捷、简便可靠、低成本的检测方法仍是研究的主流趋势。

胶体金快速检测技术具有快速准确、操作简便、容易学习的特点，非常适用于基层监管部门开展大批量的快速定性筛查检测，应用前景广阔。为此，本研究对福建省水产研究所研制的石房蛤毒素胶体金快速检测试纸卡进行了应用测试，结果表明，该试纸卡在贝类产品中具有普遍适用性，对石房蛤毒素的检测限为500 μg/kg，低于国际限量标准800 μg/kg；检测方法简单、快速、准确，单个样品检测耗时约20 min，仅需配备简单小型仪器即可，对检测人员操作水平要求不高，能够满足现场检测需要。虽然该试纸卡目前只能进行定性检测，但可作为有效的辅助检测手段应用于贝类样品的初筛检测，能对行政指令性的监督抽查工作起到良好的补充作用；同时有助于形成“快检初筛+实验室确证”的科学监管模式，弥补多年来赤潮灾害防范工作中麻痹性贝毒监测技术手段的不足，对加强贝类质量安全监管、提高海洋渔业赤潮防灾减灾能力、进而保障渔业经济持续健康发展具有重要意义。