NaCl 胁迫下外源尿囊素对菊花叶绿素荧光特性及活性氧清除酶系统的影响

刘真真,梁明珠,段利萍,刘 洋,郑成淑,孙宪芝,王文莉

山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室,山东 泰安271018

菊花(Chrysanthemum morifoliumRamat.)是菊科菊属多年生宿根花卉，是我国的十大传统名花之一，也是世界四大切花之一。菊花具有极高的观赏和经济价值，在花卉生产应用中占有非常重要的地位。目前我国的切花菊生产，主要是在设施大棚内进行。由于设施内一般采用大水浇灌且次数频繁、蒸腾量大，土壤中盐分无法及时随雨水流走或淋溶到土壤深层，而是残留在了土壤耕层，使土壤中含盐量累加，严重影响切花菊的生产和品质。

尿囊素（allantoin，C4H6O3N4），简称All，广泛存在于动植物体内。在高等植物中嘌呤降解是All 合成的主要途径。首先腺嘌呤核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）与鸟嘌呤核苷酸（guanosine monophosphate，GMP）在细胞质基质中经过脱氨等作用生成尿酸[1]。尿酸在尿酸氧化酶（urate oxidase，UOX）作用下生成5-羟基异尿酸盐，然后在尿囊素合酶（allantoin synthase，AS）作用下生成All。这个过程在过氧化物酶体中进行[2]。在酰脲渗透酶（ureide permease，UPS）和其他转运蛋白（allantoine transporter）的作用下，植物合成的All 进入细胞质参与发挥作用[3]，或者分泌到细胞间质，参与氮素转运[4]。植物细胞中的内质网是是All 分解代谢的主要场所[5]。All 经过尿囊素酶（allantoinase）和尿羟乙酸裂解酶（ureidoglycolate lyase）作用下最终转化成乙醛酸（glyoxylate）并生成尿素，或者是在尿囊素酶和尿羟乙酸水解酶（ureidoglycolate hydrolase）的作用下转化成乙醛酸、NH3和CO2[6]。

在高等植物中，All 不仅是氮素转运和存储过程中的重要物质，参与植物体内氮素转运、存储以及再利用等活动，而且在植物抗逆方面有重要作用。近年来研究表明，植物在营养缺乏[7]、高辐照度[8]、高盐[9]以及干旱[10]等胁迫条件下，均伴有All 的积累。同时，体内较高的All 水平或者外施All又可诱导植物体的一系列胁迫应答反应[11]。对拟南芥尿囊素酶功能缺失突变体（aln）的研究发现，aln 植株中尿囊素的大量累积自发地启动ABA 合成，进而诱导植物体内抗逆应答相关基因的表达，提高了拟南芥突变体幼苗对非生物胁迫的耐受性。此外，野生型拟南芥外施尿囊素后，表现出与aln植株相似的抗逆性提高表型[12]。由此可见尿囊素在植物体抗逆应答中起着非常重要的作用。Brychkova 等[13]研究表明，外源施加尿囊素降低了黑暗胁迫下拟南芥H2O2含量并且增加了叶片中的叶绿素含量。目前外源尿囊素对提高植物抗逆性的研究不多，在缓解菊花盐胁迫方面的研究未见报道。为此，本试验以切花菊‘神马’为试材，研究不同浓度的外源All 对NaCl 胁迫下菊花幼苗的生物量、叶绿素荧光、活性氧含量和抗氧化酶的影响，以期探讨All 在缓解盐胁迫方面的作用和机制，筛选最佳缓解菊花NaCl 胁迫的尿囊素浓度，为合理利用外源All 解决菊花设施栽培中的盐害问题和培育抗盐菊花品种提供科学依据。

1 材料与方法

试验于2017 年3 月～2018 年10 月在山东农业大学园艺试验站和园艺学院中心实验室进行。

1.1 试验材料

供试菊花品种‘神马’（Chrysanthemum morifolium‘Jinba’）插穗取自山东农业大学园艺试验站温室中生长健壮的母株。扦插苗生根后定植于盛有栽培基质（园土:草炭:蛭石=2:1:1）的塑料盆中（1盆1 株），一个月后，挑选生长一致、长势良好的植株，进行试验处理。NaCl 浓度从40 mmol·L-1、70 mmol·L-1、100 mmol·L-1逐步增加到140 mmol·L-1，盐适应共28 d。于第29 d 开始测定叶绿素荧光参数，每两天测定一次，测定10 d，共测6 次。试验共设7 个处理，每处理10 盆，3 个重复。处理1（CK）：叶片喷水，根部浇不含NaCl 营养液；处理2（T0）：叶片喷水，根部浇140 mmol·L-1NaCl（营养液从塑料盆下部渗漏为止）；处理3（T1）：140 mmol·L-1NaCl+1 mmol·L-1All；处理4（T2）：140 mmol·L-1NaCl+2 mmol·L-1All；处理5（T3）：NaCl+3 mmol·L-1All；处理6（T4）：140 mmol·L-1NaCl+4 mmol·L-1All；处理7（T5）：140 mmol·L-1NaCl+5 mmol·L-1All。每隔一天喷施一次All，均匀喷洒在叶片的正、反面，以不滴液为度，对照喷蒸馏水，共5 次。于喷施All 处理后0、2、4、6、8 和10 d测定叶绿素荧光参数；于喷施All 处理10 d 时对植株进行生长量的测定，并取植株自顶部往下第4～5片完全展开的功能叶，测定其他各项生理指标。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 叶绿素荧光参数 每次测定时间在上午10：00～11：00，每个处理随机选3 盆，采用英国Hansatech公司生产的FMS-2 型脉冲调制式荧光仪，测定植株顶部向下第4 片完全展开功能叶的叶绿素荧光参数。测定前将叶片暗适应15 min，以弱检测光测定初始荧光（Fo），之后以饱和脉冲光测定最大荧光（Fm）。当荧光从Fm回落至接近Fo时，以连续的作用光测定稳态荧光（Fs）。之后叠加一个饱和脉冲光，测定光下最大荧光（Fm'）。最后关闭作用光，并立即打开远红光，测定光下最小荧光（Fo'）。可变荧光（Fv）按Fm-Fo计算，PSII 的最大光化学效率按Fv/Fm计算，PSII 的量子产额（ΦPSII）按（Fm'-Fs）/Fm'计算，光化学猝灭系数（qP）按（Fm'-Fs）/（Fm'-Fo'）计算，非光化学猝灭系数（qN）按1-（Fm'-Fo'）/（Fm-Fo）。

1.2.2 其他生理指标测 过氧化氢(H2O2)含量测定参照碘化钾法；超氧阴离子(O2·-)生成速率采用羟胺氧化法测定；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）法；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法[14]；利用UV-245 紫外分光光度计（日本Shimadzu 公司）测定吸光光度值，各指标数据测定重复3 次。

1.3 数据处理

采用Excel 2007 软件对数据进行处理和作图，利用SPSS 22.0 软件进行相关性分析和方差分析，并运用Duncan 检验法对显著性差异进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 NaCl 胁迫下外源尿囊素对菊花叶绿素荧光参数的影响

图1 NaCl 胁迫下外源尿囊素对菊花叶绿素荧光参数的影响Fig.1 Effects of exogenous allantoin on chlorophyll fluorescence parameters of chrysanthemum under NaCl stress

由图1（A～F）可以看出，NaCl 胁迫下菊花的Fo和qN上升，Fv/Fm、ΦPSII、qP和ETR下降，不同浓度的All 均可以提高胁迫植株的ΦPSII和Fv/Fm值，其中外源喷施3 mmol·L-1All（T3）的植株Fv/Fm值显著高于NaCl 胁迫的植株，第10 d 时Fv/Fm值为0.422，是NaCl 胁迫植株的1.73 倍，说明外源喷施3 mmol·L-1All 可以提高菊花NaCl 胁迫下的光能转换效率，缓解NaCl 胁迫对菊花光系统的伤害。

NaCl 胁迫造成了菊花植株qP的持续下降，但喷施外源不同浓度的All 后，菊花植株的qP始终高于NaCl 胁迫的植株，处理第10 d 时，分别提高了43.40%、62.01%、63.45%、37.82%和47.55%，其中3 mmol·L-1All 较于对照（CK）降幅最小，为0.644。除了1 mmol·L-1和2 mmol·L-1浓度的All外，3～5 mmol·L-1浓度的All 处理均减缓了盐胁迫植株qN的上升，处理第10 d 时分别较NaCl 胁迫的植株降低了10.87%、22.31%和32.29%。

由图1（F）可见，NaCl 胁迫引起光合电子传递速率（ETR）显著下降，而外源喷施All 后，不同浓度All 均可以使菊花植株的ETR上升，其中3 mmol·L-1All 处理植株的ETR和对照接近。说明All 可以有效提高NaCl 胁迫下菊花植株的相对电子传递效率。

2.2 不同浓度外源尿囊素对NaCl 胁迫下菊花株高和干重的影响

如表1 所示，喷施All 处理10 d 时，菊花株高和地上部干重及根系干重均有不同。NaCl 胁迫下（T0）的菊花株高与CK 相比显著降低了9.96%（P＜0.05），2～4 mmol·L-1的外源All 显著增加了植株的株高，在3 mmol·L-1All 处理下（T3），菊花植株株高较NaCl 胁迫下未喷施All 处理的（T0）增加最多，提高了3.85%，1 mmol·L-1和5 mmol·L-1的All 处理的植株株高有所增加，但增幅不显著。NaCl 胁迫下，菊花地上部干重和根系干重与对照（CK）相比均显著下降（P＜0.05），分别降低了12.59%和22.33%，外源喷施All 后，不同浓度处理的菊花植株地上部干重均有不同程度地升高，其中，3 mmol·L-1All 处理下，菊花地上部干重较NaCl 胁迫提高了8.21%，达到显著性差异（P＜0.05），与没有NaCl 胁迫的植株（CK）株高差异不显著；喷施All 后根系干重较单纯NaCl 胁迫处理的植株变化差异不显著。

表1 不同浓度外源All 对NaCl 胁迫下菊花株高和干重的影响Table1 Effects of exogenous allantoin on plant height and dry weight of chrysanthemum under NaCl stress

2.3 NaCl 胁迫下外源尿囊素对菊花O2·—、H2O2、SOD 和POD 的影响

喷施外源All 处理10d 对NaCl 胁迫下菊花O2·-、H2O2、SOD 和POD 的影响见图2。

图2 NaCl 胁迫下外源尿囊素对菊花O2·-（A）、H2O2（B）、SOD（C）和POD（D）的影响Fig.2 Effects of exogenous allantoin on O2·-（A）、H2O2（B）、SOD（C）and POD（D）in chrysanthemum under NaCl stress

从图2（A、B）可知，NaCl 胁迫下菊花叶片中O2·-产生速率显著上升、H2O2含量显著增加。3、4、5 mmol·L-1浓度的外源All 处理均显著降低了菊花O2·-产生速率（P＜0.05），以3 mmol·L-1处理的降幅最大。3 mmol·L-1和4 mmol·L-1的外源All 处理可以显著降低菊花叶片中H2O2的含量（P＜0.05）。如图2（C）所示，NaCl 胁迫下，SOD 活性与对照相比没有显著差异，喷施不同浓度的的外源All均显著增强了菊花植株的SOD 活性。All 浓度为3 mmol·L-1时，菊花叶片中H2O2的含量以及O2·-产生速率最低，较NaCl 胁迫处理（T0）分别降低了21.90%和27.92%，且SOD 的活性最强，是NaCl胁迫处理的2.30 倍。而处理植株（T0～T5）的POD 活性均显著高于对照（CK），除5 mmol·L-1All 处理外，其余浓度All 处理均显著低于NaCl 胁迫时未用All 处理植株（T0）。

3 讨论

叶绿素荧光参数可以有效反映植物受逆境胁迫后光合系统的受损程度[15]。在本研究中，随着NaCl 胁迫时间的延长，菊花的Fo表现出持续上升，Fv/Fm、ΦPSII实际光化学效率（ΦPSII）和ETR持续下降，说明NaCl 胁迫对PSII 反应中心产生了抑制，植株叶片同化CO2的能力下降，对叶绿体中的ATP 和NADPH 的需求量降低，造成光能过剩[16]。NaCl 胁迫下喷施外源All 后，菊花ΦPSII值和ETR上升，且菊花叶片的Fv/Fm值始终高于NaCl 胁迫的植株，说明All 可能降低了叶绿体中活性氧含量，增强了光合系统的活性，因此PSII 开放的反应中心比例和参与CO2固定的电子有所增加，光合电子传递能力提高，同时光合色素捕获和转化光能的效率增加，叶片暗反应的受阻情况有所缓解。随着NaCl 胁迫时间的延长，菊花植株的qP下降、qN持续上升，胁迫对光合机构产生了光抑制，植株通过热耗散消耗植株中过剩的光能，缓解PSII 的损伤程度。而喷施3～5 mmol·L-1的All 后qP上升，表明天线色素吸收的光能用于光合作用的份额增加，光合机构活性增强；qN下降，表明植株内以热能耗散的光能数量减少，用以进行光合作用的能量增加。

在NaCl 胁迫下，高浓度的活性氧能引起DNA、蛋白质和脂质过氧化，破坏膜结构。在正常生理状态下，抗氧化酶系统可使活性氧的产生和消除维持在一种动态平衡状态。本研究中，在NaCl胁迫下外源喷施All 后显著降低了植株叶片中的O2·-产生速率和H2O2，这与Nourimand M[17]的研究结果一致，All 可能作为一种活性氧清除剂发挥作用，减轻了因ROS 增多对细胞质膜产生的破环。逆境胁迫下导致植物活性氧水平增加的同时，植物体内的SOD 和POD 作为最重要的抗氧化酶也被激发，主要作用是清除富余活性氧，维持自由基生成与消除的动态平衡[18]。本研究中，NaCl 胁迫下菊花叶片中SOD 活性与对照没有明显差异而POD 活性增加，可能是由于处理第10 d 细胞内的活性氧含量已经超出了SOD 的清除范围，SOD 酶系统较POD 更早地受到破坏。外源喷施All 后SOD 活性显著增强而POD 活性降低，推测外施All 后，脯氨酸等物质的增加稳定了酶结构，提高了SOD的活性。SOD 将植物体内多余的O2·-转化为H2O2，导致H2O2大量累积。理论上来说，POD 会将H2O2转化成为对植物细胞无害的氧气和水，从本研究结果看，1～4 mmol·L-1All 处理植株的POD 活性均显著低于NaCl 胁迫植株（T0），POD 活性下降而H2O2含量也有所降低，可能是All 作为一种活性氧清除剂参与了H2O2的清除而替代了POD 的作用，有待进一步研究。

植株生物量积累与植物耐盐性密切相关，生长量的变化可以综合反映出植物对NaCl 胁迫的响应[19]。本研究中，NaCl 胁迫下菊花的株高、地上部分的干物质累积量和根系的干物质积累量均显著下降，说明NaCl 胁迫对菊花植株生长具有明显的抑制作用，植株的株高、地上部分和地下部分变化程度有所不同，可能是逆境条件下植物通过调整不同部位生物量的累积来应对外界不利环境条件，有研究表明，在NaCl 胁迫下，植物主要是由于不同生长部位对盐分敏感性的差异而进行生物量分配模式的调整[20]。本研究结果表明，在一定浓度范围内，NaCl 胁迫下施加外源尿囊素（All）处理后菊花的株高、地上部分干物质积累均有明显提高，说明All 可以缓解盐胁迫对植物生长的抑制。而地下部分生物量没有较显著的改善，可能由于监测时间短根系结构影响变化不大。

综上所述，在NaCl 胁迫下外源喷施All 可以缓解胁迫对菊花植株PSII 活性的抑制，提高SOD活性并可能作为活性氧清除剂清除细胞内多余的O2·-和H2O2以提高植株对NaCl 胁迫的抗性，从而对NaCl 胁迫下菊花植株生长抑制起到缓解作用，且以3 mmol·L-1的All 处理效果最好。