LASP1和HIF-1α在肺癌中的表达及临床价值

李黎, 张文琪, 李强, 孙瑶

潍坊市益都中心医院放疗科(山东潍坊 262500)

肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近些年肺腺癌发生比例增加。目前靶向药物如EGFR-TKI的应用提高肺癌患者生存，但预后仍较差[1]。目前常用的肿瘤标记物在预测预后方面敏感度和特异度较差。因此，探索新的检测及预后因子对于提高肺癌患者生存有着重要的意义[2]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)最初研究是介导细胞适应缺氧的关键转录因子，最近研究证实即使在常氧条件下，HIF-1α在肿瘤细胞中也过表达。HIF-1α与肿瘤进展、血管生成、细胞迁移和预后不良密切相关[3-4]。HIF-1α可能是肿瘤治疗的一个新靶点。LASP1(LIM and SH3 protein 1)是一种肌动蛋白结合蛋白，LASP-1蛋白定位于人染色体17q21。有研究报道LASP-1过表达可诱导多种肿瘤细胞的增殖和迁移[5-6]。体内外实验证实HIF-1α通过直接结合LASP1启动子中的缺氧反应元件进而导致肿瘤发生侵袭转移[7]。然而在肺癌中LASP1和HIF-1α研究较少。本研究回顾分析LASP1和HIF-1α在肺癌中表达及其与临床病理因素之间相关性，探讨LASP1和HIF-1α在肺癌中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究纳入标准为：(1)2002年10月至2012年10月于我院诊断为Ⅰ～ⅢA期行手术治疗确诊的有完整病理的肺腺癌患者；(2)所有患者都行表皮生长因子受体(EGFR)基因检测；(3)术前检查无远处转移；(4)围手术期内未死亡的患者。

病例剔除标准： (1)未行根治性手术患者； (2)无完整随访资料。根据纳入排除标准本组共77例肺癌患者纳入本研究。其中男50例，女27例；年龄≤60岁 43例，>60岁34例；吸烟患者34例，不吸烟患者43例；EGFR基因突变患者25例；未突变患者52例。

1.2 qRT-PCR(定量PCR) 肺癌细胞株(A427, A549, H1299)和正常肺细胞株(MRC-5)均购于中国科学院。将其培养在RPMI 1640培养基中，添加10%胎牛血清和1%青霉素链霉素，37℃孵育在5%的CO2中。qRT-PCR具体步骤如下：试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)从细胞系提取总RNA，用反转录系统将1 μL总RNA反转录为20 μL cDNA。引物见表1，反应系统中，95℃反应30 s，55℃反应30s，72℃，持续30 s。32个周期，实验重复3次，最后计算2-ΔΔCT值。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.3 Western blot 将细胞在RIPA裂解缓冲液中均匀化30 min，在4℃下离心(12 000 r/min)，将裂解液清除15 min，用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白提取物，电转移至PVDF。用5%脱脂牛奶阻断非特异性结合位点60 min后，在4℃下与兔抗 HIF-1α (1∶1 000)和兔抗LASP-1(1∶1 000)多克隆抗体孵育隔夜。用PBS-T洗涤膜3 min，用辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗兔免疫球蛋白抗体(SP-9001，1∶2 000；中山生物技术)在室温下检测60 min。然后用PBS-T对膜进行3次洗涤10 min，用增强化学发光系统观察免疫复合物。

1.4 免疫组化检测及评价 标本被切割，脱蜡，用二甲苯和分级醇再水合。抗原回收在5 mmol/L柠檬酸缓冲液中进行。用3%H2O2灭活内源性过氧化物酶后，用山羊血清阻断切片，在4℃下与HIF-1α抗体(1∶100)或LASP-1抗体(1∶100)孵育一夜，PBS冲洗，37℃下与二抗孵育20 min，然后洗涤。PBS冲洗3次。以二氨基联苯胺为显色底物。最后，用血木素对切片进行反染色。染色强度分为0(阴性)、1(低)、2(中)和3(高)。染色范围分为0(0%染色)、1(1%～25%染色)、2(26%～50%染色)和3(51%～100%染色)。最终评分通过将强度评分与染色程度相乘来确定，范围0～9。根据结果将免疫反应分为阴性表达(0～3分)和阳性表达(>3分)[8]。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件，t检验分析两组之间的差异。2检验进行相关性分析，预后生存分析采用Kaplan-Meier进行单因素分析，log-rank比较组间差异。Cox多因素分析确定预后独立因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LASP1和HIF-1α mRNA和蛋白表达情况 qRT-PCR检测LASP1和HIF-1α mRNA表达情况，结果显示 LASP1和 HIF-1α mRNA在肺细胞株MRC-5(0.43±0.10；0.39±0.09)中的表达明显低于在肺癌细胞株A427(0.73±0.14；0.69±0.12)、A549(0.87±0.25；0.75±0.22)和 H1299(0.79±0.19；0.65±0.14)中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测LASP1和HIF-1α蛋白表达情况，结果显示 LASP1和 HIF-1α 蛋白在肺细胞株MRC-5(0.74±0.22；0.67±0.17)表达明显低于肺癌细胞株A427(1.34±0.24；1.43±0.21)、A549(1.42±0.21；1.29±0.24)和 H1299(1.51±0.22；1.21±0.22)在中的表达，差异有统计学意义(图1)。

图1 Western blot检测LASP1和HIF-1α蛋白表达相对值

2.2 LASP1和HIF-1α表达与临床因素之间相关性 免疫组化结果显示LASP1和HIF-1α表达在细胞胞质中(图2)。按判定标准，49例患者为LASP1阳性表达组，其余28例患者为LASP1阴性表达组；41例患者纳入HIF-1α阳性表达组，其余36例患者纳入HIF-1α阴性表达组。肺癌石蜡组织中LASP1表达和HIF-1α表达呈正相关(r=0.273，P=0.025)。

将LASP1表达和HIF-1α表达与临床因素间进行相关分析，结果显示LASP1表达与N分期(P=0.033)密切相关，而HIF-1α表达与LASP1表达与T分期(P=0.027)和N分期(P=0.015)密切相关(表2)。

注：A：肺腺癌组织中LASP1阳性表达；B：肺腺癌组织中LASP1阴性表达；C：肺腺癌组织中HIF-1α阳性表达；D：肺腺癌组织中HIF-1α阴性表达

表2 LASP1表达和HIF-1α表达与临床病理因素之间相关性分析 例

2.3 预后生存分析 预后单因素分析显示T分期(P=0.026)，N分期(P<0.001)，LASP1表达和(P=0.019)和HIF-1α表达(P=0.001)与本组预后相关，而性别、年龄、吸烟状态、肿瘤部位和EGFR状态与本组肺癌患者预后无关(P>0.05)。Cox预后多因素分析N分期(HR=1.563，P<0.001)、LASP1表达(HR=0.494，P=0.032)和HIF-1α表达(HR=0.451，P=0.010)为本组患者预后独立因素(表3)。进一步分析发现LASP1阳性表达患者和HIF-1α表达阳性患者预后较LASP1阴性表达患者和HIF-1α表达阴性患者预后差(图3)。

3 讨论

Semenza于1992 年在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的HIF-1。HIF-1是HIF-1α和 HIF-1β 构成的异二聚体， HIF-1α是主要的氧调节亚基[9-10]。人类实体肿瘤中常存在缺氧环境，目前 HIF-1α已在多种恶性肿瘤中检测到过度表达。肿瘤发生早期即可发生HIF-1α的过度表达，有研究报道HIF-1α参与肿瘤生长、血管形成、侵袭转移有关[11]。低氧环境下多种基因的转录和表达发生变化，对缺氧作出应激反应，这些基因被称为缺氧反应基因。缺氧反应基因常为HIF-1α下游基因，其表达受HIF-1α基因调控。有研究证实LASP1就是HIF-1α的一个下游靶基因，受HIF-1α基因直接调控[7]。LASP1为肌动蛋白结合蛋白，主要分布于细胞的黏着斑和伪足等结构附近，可影响伪足的延伸，因此被认为是一种肿瘤转移相关蛋白[12]。LASP1在肝癌、食管癌和膀胱癌等实体肿瘤中异常高表达，并对肿瘤的发生、发展起促进作用。其他研究发现LASP1的表达与结直肠癌的淋巴结转移有关，并可通过EMT通路影响细胞的侵袭和迁移能力[13]。有报道LASP1可通过LASP1/PTEN/AKT在鼻咽癌的进展中起重要作用，LASP1可能作为鼻咽癌的治疗潜在靶点[14]。然而肺癌中LASP1和HIF-1α相关性研究较少。

注：A：根据不同HIF-1α表达情况肺癌患者预后生存曲线；B：根据不同LASP1表达情况肺癌患者预后生存曲线

表3 本组肺癌患者预后生存分析

本研究首先检测了细胞株中mRNA和蛋白的表达情况，我们发现肺癌细胞株中LASP1和HIF-1α mRNA和蛋白表达水平均明显高于正常肺细胞株，HIF-1α表达与T分期、N分期有关，LASP1表达与N分期(P=0.033)密切相关，分期越晚，HIF-1α和LASP1阳性表达越高。我们推测HIF-1α和LASP1与肺癌淋巴结转移密切相关。本研究还发现HIF-1α和LASP1表达在肺癌中的表达呈正相关，结合之前研究我们推测在肺癌中HIF-1α异常高表达，HIF-1α进一步刺激LASP1基因过表达，进而导致下游基因激活，进而导致肺癌进展。为了评估HIF-1α表达和LASP1表达在肺癌中的预后价值，我们采用预后生存分析。结果表明N分期、HIF-1α表达和LASP1表达是肺癌患者独立的预后指标。此外，我们证明LASP1阳性表达患者和HIF-1α表达阳性患者预后较LASP1阴性表达患者和HIF-1α表达阴性患者预后差。这些结果提示，HIF-1α和LASP1过表达的肺癌患者可能是预后不良的高危人群，可能需要更积极的治疗。

本研究发现LASP1和HIF-1α在肺腺癌中高表达，HIF-1α和LASP1可能与肺癌淋巴结转移密切相关，LASP1和HIF-1α可作为肺腺癌患者预后预测指标。