结核感染T细胞斑点试验联合胸腔积液Xpert MTB/RIF检测诊断结核性胸腔积液的价值

张新宝, 张妍蓓, 姚超△, 洪青青, 韩波波, 张毕玲

1安徽省胸科医院结核六科(安徽合肥 230022)； 2安徽医科大学第一附属医院干部呼吸内科(安徽合肥 230000)

结核病是危害公共安全的主要传染病之一，据2017年WHO最新一次的流行病学统计显示：全世界新发结核感染患者约 1 040 万例，我国估算的发病数约为 93 万例，发病率为 68/10 万，居第3位[1]。我国是结核病高负担国家，结核性胸膜炎的诊断往往依靠临床经验，传统的检测方法如：胸腔积液抗酸染色、胸腔积液细胞学、胸腔积液结核分支杆菌培养等检测，准确率较低且耗时较长，缺乏早期的病原学诊断依据。因此，临床实践过程中迫切需要一种安全简便的诊断方法，以便有效减少误诊率，达到早期诊断和治疗。笔者通过对安徽省胸科医院收治的 112例胸腔积液患者进行结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)和胸腔积液结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert Mtb/RIF)联合检测，探讨两者联合诊断的价值，为结核性胸腔积液的诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取安徽省胸科医院2018年6月至2019年6月收治的112例胸腔积液患者为研究对象,依据中华医学会结核性胸膜炎临床诊疗指南[2]，临床诊断或确诊为结核性胸腔积液患者76例(结核组)，非结核性胸腔积液36例(非结核组)。其中男86例，女30例；年龄(59.02±4.94)岁。治疗前同步收集每例患者胸腔积液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB、胸腔积液Xpert MTB/RIF、胸腔积液ADA进行检测，对检测结果进行回顾性分析。

1.2 入选标准 依据中华医学会结核病学分会《肺结核诊断和治疗指南》结核性胸腔积液诊断指标：(1)胸腔积液结核涂片、培养、或胸腔积液细胞学中查到结核分支杆菌；(2)胸膜活检病理学检查显示为结核性肉芽肿；(3)影像学表现符合结核性胸膜炎；(4)临床特点符合结核性胸膜炎;(5)抗结核药物治疗2个月后，临床症状及复查影像学表现有好转。符合1、2任意一项或3、4、5至少两项可诊断为结核性胸膜炎。

1.3 排除标准 上述患者诊断均按照相关诊断标准，同时需要排除[3]：(1)并发人类免疫缺陷病毒感染；(2)同时合并自身免疫系统相关疾病；(3)妊娠；(4)器官移植或使用免疫抑制剂；(5)血性胸腔积液；(6)其他器官病变终末期。

1.4 检验方法

1.4.1 胸腔积液T-SPOT.TB 试剂采用为(英国 Oxford Immunotec Ltd)T-SPOT.TB，治疗前留取患者胸腔积液80～100 mL，加入肝素钠一支(1.25万IU)抗凝，及时送检保证标本的新鲜度，分别对抗原A、抗原B、阴性对照(非血清培养基)、阳性对照(植物血凝素)进行检测，对试验结果进行判读。

1.4.2 外周血T-SPOT.TB 采用T-SPOT.TB试剂为 (英国 Oxford Immunotec Ltd)，严格按照产品试剂说明书操作，分离外周血单核细胞，计数后并调整细胞浓度。

1.4.3 T-SPOT.TB 阳性判定标准为:当阴性对照孔斑点数为 0～6,(抗原 A 或抗原 B 斑点数)-(阴性对照孔斑点数)≥6。当阴性对照孔斑点数≥6,(抗原 A 或抗原 B 斑点数)≥2 倍(阴性对照孔斑点数)[4]。

1.4.4 胸腔积液Xpert MTB/RIF 采用美国Cepheid公司生产的Xpert MTB/RIF检测仪及试剂盒，常规留取胸腔积液，标本中加入消化液，消化液与胸腔积液的比例为1∶1(V/V)，拧紧试管盖子，反复摇动数次。常温放置15 min，标本中无肉眼可见块状物时，提取2 mL标本加入Xpert MTB/RIF反应试剂盒中，放入Gene Xpert平台中，等待2 h后，查看结核菌检测结果。

1.4.5 胸腔积液腺苷脱氨酶(ADA)检测 采用(浙江伊利康生物有限公司)腺苷脱氨酶试剂，留取患者胸腔积液5～10 mL，加入抗凝玻璃试管中，严格按照试剂说明书进行操作，ADA数值>40 U/L视为阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件，采用2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4种方法检测结果情况比较 胸腔积液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB、胸腔积液Xpert MTB/RIF以及胸腔积液ADA检测结果见表1。76例临床诊断或确诊为结核性胸腔积液的患者中，胸腔积液T-SPOT.TB阳性74 例、外周血T-SPOT.TB阳性 58 例、胸腔积液Xpert MTB/RIF阳性 50例、胸腔积液ADA检测阳性 22例。36例非结核性胸腔积液患者中，胸腔积液T-SPOT.TB阴性 28例、外周血T-SPOT.TB阴性 20 例、胸腔积液Xpert MTB/RIF阴性 36例、胸腔积液ADA检测阴性18 例。4种检测手段与临床诊断进行比较，差异有统计学意义(2=70.34、11.07、42.78、4.72,P<0.05)。

2.2 4种方法单独检测和胸腔积液Xpert MTB/RIF与胸腔积液T-SPOT.TB联合检测的比较

2.2.1 4种单独检测的效能分析 胸腔积液T-SPOT.TB检测的敏感度(97.37%)，明显高于外周血T-SPOT.TB检测的敏感度(76.32%)、胸腔积液Xpert MTB/RIF检测的敏感度(65.79%)和胸腔积液ADA检测的敏感度(28.95%)差异均有统计学意义(2=14.74、25.22、76.45，P<0.01)。胸腔积液Xpert MTB/RIF检测的特异度(100%)明显高于胸腔积液T-SPOT.TB检测的特异度(77.78%)、外周血T-SPOT.TB检测的特异度(55.56%)和胸腔积液ADA检测的特异度(50.00%)，差异均有统计学意义(2=6.89、20.57、24.00，P<0.01)。

表1 4种检测方法结果的比较 例(%)

2.2.2 两种联合检测方法的效能分析 将胸腔积液Xpert MTB/RIF和胸腔积液T-SPOT.TB检测均为阳性判定为阳性，将其中两项均为阴性或其中一项为阴性判定为阴性。胸腔积液Xpert MTB/RIF和胸腔积液T-SPOT.TB检测的敏感度为64.47%，低于胸腔积液T-SPOT.TB单独检测(97.37%)，差异有统计学意义(2=26.63、P<0.01)，但特异度由胸腔积液T-SPOT.TB检测的77.78%提高至100%，差异有统计学意义(2=45.82、P<0.01)。见表2。

表2 胸腔积液Xpert MTB/RIF联合胸腔积液T-SPOT检测与4种单独检测的比较 %(例)

2.3 受试者工作曲线分析 本研究采用受试者工作特征(ROC)曲线来分析结核性胸腔积液诊断的最佳界值,胸腔积液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB、胸腔积液Xpert MTB/RIF胸腔积液ADA的ROC曲线下面积(AUC)分别为：0.91、0.66、0.81和0.45。胸腔积液T-SPOT.TB检测效能明显高于外周血T-SPOT.TB、胸腔积液Xpert MTB/RIF和胸腔积液ADA。见图1。

3 讨论

结核性胸腔积液在胸腔积液患者中约占49.5%～54.5%[5],结核性胸腔积液中,胸腔积液抗酸杆菌涂片阳性率仅为0%～25%,胸腔积液结核菌培养阳性率为11.7%～56.8%[6],因此临床上需要一种快速有效的检测方法，以便早期诊断，早期治疗，减少因结核性胸腔积液所致的结核性脓胸、肺毁损等并发症[7]。

图1 4种检测方法的ROC曲线

外周血T-SPOT.TB检测是采用酶联免疫斑点技术，检测在结核分枝杆菌(MTB)特异性抗原刺激下，外周血样本中单核细胞所释放 干扰素的效应T细胞的数量，采用MTB的RD1基因编码相对分子量为6 000的分泌抗原靶(ESAT-6)和相对分子量为10 000培养滤过蛋白(CFP-10)作为特异性抗原。该方法越来越多应用于临床结核病的诊断中[8]。但外周血T-SPOT.TB存在自身缺陷，易受外周血T淋巴细胞数量的影响[9],常常会出现假阳性的结果,笔者分析假阳性结果可能的原因有：(1)我国是结核病高负担国,结核潜伏感染人数众多, T-SPOT.TB检测技术不能区分结核潜伏感染和活动性结核。(2)存在一些特殊的非结核分枝杆菌感染,如:感染海分枝杆菌堪萨斯分枝杆菌时, T-SPOT.TB检测有时也会出现假阳性的结果。(3)存在某些目前尚不能检测的肺外结核病。(4)感染,炎症同时并发一过性感染时,也可能出现T-SPOT.TB阳性的结果[10]。(5)某些癌症患者的肿瘤抗原与两种结核抗原(CFP-10、ESAT-6)存在着交叉表位,致使肿瘤T细胞也会对两种结核抗原产生免疫反应，致使其诊断活动性结核病的特异度受限制。

胸腔积液T-SPOT.TB检测,是检测在MTB特异性抗原的刺激下,收集的胸腔积液样本中单核细胞所释放干扰素的效应T细胞的数量。结核分枝杆菌感染致使胸腔内炎症渗出，机体内的T淋巴细胞、B淋巴细胞聚集在结核感染部位，致使胸腔局部隔式化效应增大，因此胸腔积液中的结核特异性抗原T淋巴细胞数量明显高于外周血，且胸腔是一个相对无菌的环境，受外界外界干扰或MTB潜伏感染的影响较小，更广泛用于结核性胸腔积液的诊断[11]。安徽省胸科医院通过对116例胸腔积液患者进行研究发现，胸腔积液T-SPOT.TB敏感度97.5%(78/80),高于血T-SPOT.TB 80%(64/80)、胸腔积液ADA 67.5%(54/80)、血TB-Ab 27.5%(22/80),差异均有统计学意义(P<0.01)，胸腔积液T-SPOT.TB在结核性胸膜炎的特异度91.67%(33/36),高于血T-SPOT.TB 58.33%(21/36)、胸腔积液ADA 72.22%(26/36)、血TB-Ab 55.56%(20/36),差异均有统计学意义(P<0.05)[12]。付洪义等[13]通过对老年结核性胸膜炎患者研究发现,胸腔积液IGRA的敏感度为90.79%,特异度为98.25%,明显高于外周血的67.11%和84.21%,差异有统计学意义。邹兴武等[14]通过对239例结核性胸膜炎的临床资料和试验数据研究发现, T-SPOT．TB假阴性与患者的年龄、外周血淋巴细胞计数、血红蛋白及抗结核治疗有关，年龄越大、外周血淋巴细胞减少，血红蛋白越低，假阴性的风险越高，同时抗结核治疗也会出现假阴性的结果，因此为避免出现假阴性的结果，建议在治疗前同步抽取患者外周血及胸腔积液送T-SPOT.TB检测。同时，相关研究显示[15]T-SPOT.TB斑点计数与结核病的活动程度有密切相关，当发生结核性胸腔积液时，胸腔积液T-SPOT.TB抗原A孔或抗原B孔均>15时强烈提示结核性胸腔积液可能。本研究中胸腔积液T-SPOT.TB检测的敏感度与特异度与相关报道接近。

Xpert MTB/RIF检测系统，是一种半巢式自动化、全封闭、核酸扩增检测系统，因其操作过程中很少产生气溶胶，减少样本的生物危害风险，被WHO广泛推荐应用于结核病的检查[16-17]。Xpert MTB/RIF检测是同时采用6种分子探针和6种分子信标，针对rpoB基因的81bp核心区间进行检测，2 h内可快速检测利福平是否耐药[18]。Gene Xpert MTB/RIF检测广泛应用于肺结核的诊断，国外相关研究发现：95%左右的MTB耐RFP是由于RNA聚合酶的rpoB基因507-533位密码子突变所致，因此也用于耐药肺结核的诊治[19-20]。但Gene Xpert MTB/RIF对肺外结核特别是结核性胸腔积液的研究较少，国内外对其诊断价值缺乏统一的认识。据相关报道显示[21]，Gene Xpert MTB/RIF检测在肺外结核诊断的敏感度为25.0%～96.6%，特异度在100%, 说明该项检测技术在肺外结核的的诊断同样具有较高的价值。本研究所采用的Xpert MTB/RIF检测技术,操作快速、简单，对人员要求较低，标本含菌量在10～100个/mL即可被检出[22]。因此，提高标本含菌量会明显提高Xpert MTB/RIF检测的阳性率。涂盛锦等[23]通过对129例胸腔积液>200 mL的患者研究发现，浓缩胸腔积液Xpert MTB/RIF检测明显高于常规胸腔积液Xpert MTB/RIF检测。胸腔积液Xpert MTB/RIF检测特异性非常高[24]。本次研究胸腔积液Gene Xpert MTB/RIF检测的敏感度为64.47%,特异度为100%,与相关报道接近,且本次研究中未发现假阳性病例，与说明其具有很好的确诊意义。

ADA广泛分布于胸腺、脾脏、及其他部位的淋巴结组织中，机体免疫功能对其影响较大，容易出现假阴性的结果[25]，因此胸腔积液ADA在结核性胸腔积液的早期诊断中具有一定的局限性。本研究的不足之处:(1)结核性胸腔积液纳入样本量相对较少,以至于胸腔积液Xpert MTB/RIF检测敏感度相对不高,期待于大样本量的统计分析；(2)非结核性胸腔积液入组病例较少，胸腔积液T-SPOT.TB检测的特异性研究还需大样本进一步验证；(3)由于胸腔积液结核分枝杆菌培养+药敏阳性率较低，且耗时长，本研究未对胸腔积液Xpert MTB/RIF检测利福平耐药与传统胸腔积液枝杆菌药敏利福平耐药做对比。

综上所述、胸腔积液T-SPOT.TB检测诊断结核性胸腔积液具有较高的敏感度，胸腔积液Xpert MTB/RIF具有较高的特异度，联合两种检测方法可明显提高诊断结核性胸腔积液的特异度，具有较高的应用价值，值得临床推广。