马铃薯蛋白质提取工艺优化及分子量的测定

李 龙，程金生，任安祥，许稳健

（1.韶关学院 英东食品学院；2.韶关学院 英东生物与农业学院，广东 韶关 512005）

新鲜马铃薯块茎蛋白质含量为1.7%～2.1%，马铃薯蛋白质按分子量大小分为高分子量蛋白质、糖蛋白、蛋白酶抑制剂3部分［1］.目前碱溶酸沉法提取马铃薯蛋白质碱溶最佳pH值在9.2～9.5之间，酸沉pH值为3.5左右［2］.碱溶最佳pH值的选择避开了酸溶碱沉蛋白质等电点pH值8.5，从而可获得更多碱溶蛋白质的提取，也防止了因pH值过高（pH＞9.5）导致浸提溶液粘度过大造成蛋白质分离困难和碱溶蛋白质的水解失去生物活性.因此碱溶酸沉法提取马铃薯蛋白质碱溶最佳pH值的选择是科学合理的.其中碱溶酸沉蛋白主要是马铃薯储藏蛋白高分子，酸溶碱沉蛋白主要是马铃薯蛋白酶抑制剂［3］.为了进一步了解马铃薯碱溶酸沉蛋白和酸溶碱沉蛋白的分离特性，本研究分别做了马铃薯碱溶酸沉蛋白和酸溶碱沉蛋白的提取方法优化和分子量测定，为将来马铃薯生物活性蛋白膜分离提取技术和层析分离纯化技术提供数据基础.

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

马铃薯（内蒙古赤峰市合作企业提供）；盐酸、硫酸、氢氧化钠等试剂均为分析纯，由广州化学试剂有限公司提供.葡聚糖凝胶：型号Sephadex G-200，购于阿拉丁试剂（上海）有限公司，已知分子量的葡萄糖标准品以及其他所需试剂均购置阿拉丁试剂（上海）有限公司.

所用仪器中：烘箱（型号Eny202266，上海精宏实验设备有限公司）；离心机（TGL-16G，上海菁华科技仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（型号UV-240，上海菁华科技仪器有限公司）；电子分析天平（型号JA5003，韶关市科力实验仪器有限公司）；立式胶体磨（型号JM-50A，广西天诨机械有限公司）.

1.2 试验方法

为了快速测定单因素实验（pH值、料液比、时间）对马铃薯蛋白质溶解度的影响，选择280 nm波长下测蛋白质测吸光度测定，吸光度与蛋白质提取率（酸提或碱提）呈反比.

为了优化工艺条件本研究采用正交实验，选择微波消化凯氏定氮法精确测定马铃薯蛋白质的提取率.

为了快速测定提取（酸提或碱提）马铃薯蛋白质在分子筛色谱过程的出峰位置，选择280 nm波长下测蛋白质测吸光度测定，吸光度与蛋白质含量呈正比.为了确定分子筛层析内标葡聚糖的出峰位置，选择了苯酚-硫酸法测定内标标准品的出峰位置.

1.2.1 马铃薯前处理

马铃薯→去皮、切块→称300 g马铃薯用1% NaCl溶液护色料液比（1∶2）→经豆浆机、胶体磨粉碎→纱布过滤→抽滤→过滤液→等体积分装，备用.

1.2.2 不同pH值时马铃薯上清液的吸光度测定

取前处理后的分装液，用浓HCl，浓NaOH溶液分别调节至设定pH→静置1 h→离心（6 000 r） →沉淀蛋白质干燥105 ℃至恒重称重→上清液在280 nm测量吸光度［5］.

1.2.3 不同料液比条件下的马铃薯上清液（pH=3.5，pH=8）吸光度的测定

马铃薯前处理条件一样，按照液料比1∶1，2∶1，3∶1，4∶1分别在pH=3.5，pH=8，时间为1 h的情况进行提取，离心后取上清液在280 nm波长下测蛋白质测吸光度，吸光度与蛋白质提取率呈反比.

1.2.4 提取时间对提取率的影响

马铃薯前处理条件一样，按照提取时间0.5、1、1.5、2 h分别在pH=3.5，pH=8，液料比2∶1的情况进行提取，离心后取上清液在280 nm下测蛋白质测吸光度，吸光度与蛋白质提取率呈反比.

1.2.5 正交实验设计

根据单因素的测定结果，确定等电点pH（A）、提取时间（B）和液料比（C）3个主要因素，从而在酸性条件和碱性条件下分别建立L9（33）三因素三水平的正交试验［8］，提取马铃薯蛋白质采用微波消化凯氏定氮法测定计算提取率，提取率=过滤液的蛋白质总量-调pH值后上清蛋白质总量/过滤液的蛋白质总量.实验方案见表1、表2.

表1 酸性性条件下正交实验因素水平

表2 碱性条件下正交实验因素水平

1.2.6 马铃薯蛋白质分子量的测定

一定体积的马铃薯过滤液调pH=3.5提取沉淀的蛋白质经碱溶后过柱分析，再经碱液中和调pH=8.5提取沉淀的蛋白质经酸溶后过柱分析，利用紫外线分光光度计确定酸溶性和碱溶性蛋白质的大致含量，通过与内标葡聚糖标准品的流出时间测定马铃薯蛋白质的分子量，从而对马铃薯酸溶和碱溶蛋白质进行初步的分析和分类.

1.2.6.1 测定内标葡聚糖含量的葡萄糖标准曲线的绘制

标准样品溶液的配制：称取葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加水适量使溶解，定容.吸取上述溶液10 mL，定容至100 mL.即得0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液［6］.

苯酚-硫酸法绘制标准曲线：用移液管移取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL的标准葡萄糖溶液，分别置于10 mL试管中，依次加水,终体积为1.0 mL［7］.另加1.0 mL的5%的苯酚，摇匀，再各加入浓硫酸5 mL，摇匀，在室温下显色10～20 min，以空白校正零点，于490 nm波长下处检测其吸光度［6］.然后以葡萄糖的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，如图1所示.

图1 苯酚-硫酸法测定葡萄糖的标准曲线

1.2.6.2 分子筛层析法测定蛋白质分子量

碱溶性蛋白质和酸溶性蛋白质分别通过酸沉碱溶、碱沉酸溶方法，各取出1 mL溶液，加水稀释至5 mL，摇匀待用.查阅资料得知马铃薯含有的3种蛋白质分子量，选取多糖分子量为1.1×105，6.06×104，1.26×104的3种标准品［7］，分别用精密天平准确称取3.0 mg，一起溶解在5 mL水中，摇匀，待用.精密天平称取标准蓝色聚多糖5.0 mg溶于50 mL容量瓶中.混匀，待用.

1.2.6.3 葡聚糖凝胶柱的制备及实验方法

（1）装柱：用 Sephadex G-200填柱.

（2）跑柱：平衡凝胶柱需过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，如果出现，必须重新装柱［9］.

（3）测定V0：取0.5 mL配制好的蓝色葡聚糖-2000上柱、洗脱，测出洗脱体积Ve.蓝色葡聚糖的Ve即为该柱的V0［8］.

（4）上样：酸提碱溶性蛋白：取上述蛋白质溶液0.5 mL，蓝色葡聚糖标准溶液0.5 mL，摇匀，在加入1 mL配置好的葡聚糖标准品溶液，摇匀.加样，过柱.由于蓝色聚多糖分子量最大，所以在柱内走的最快，因此当看到蓝色物质流出时，开始收集洗脱液，2 mL一管，共40管.按照1～40号的先后收集顺序贴好标签，待用.

（5）检样：依次取洗脱液1 mL加水稀释至5 mL在490 nm下测吸光度代表标准葡聚糖的吸光度.另依次取0.5 mL洗脱液加水至5 mL在280 nm下吸光度值代表蛋白质的吸光度，可根据标准葡聚糖和马铃薯蛋白质的出峰位置计算蛋白质分子量.

2 结果分析

2.1 单因素的分析结果

2.1.1 不同pH值对浸提马铃薯蛋白质后离心上清液吸光度的影响

马铃薯蛋白质的吸光度在酸性条件和碱性条件下均出现最小吸光度，如图2所示，说明马铃薯蛋白质有两个等电点.由图可以看出，随着pH值在2.0到13.0的范围内变化时，马铃薯蛋白质提取率的变化趋势. pH在3～4之间时上清液吸光度有一个最低值，预测该PH值与马铃薯酸性等电点较接近，pH=8左右时又出现一个吸光度最小值，预测该pH值与马铃薯碱性等电点比较接近.比较吸光度可知，马铃薯蛋白质酸性等电点蛋白质含量较高.

图 2 pH值对上清液吸光度的影响

2.1.2 不同料液比对浸提马铃薯蛋白质后离心上清液吸光度的影响

在酸性和碱性条件下，当提取液的料液比从1∶1上升至2∶1区间时，上清液的吸光度逐渐减少，马铃薯蛋白质的提取率不断升高，料液比达到2∶1为吸光度曲线拐点，如图3所示.当料液比继续升高时，溶液因体积增大数倍而吸光度略有下降，说明溶液中不沉淀蛋白质略有增加.考虑到食品加工生产过程中，料液比太大会增加后处理的负担，浪费资源，使产品成本增大，因此选取料液比2∶1左右进行提取比较适宜.

图3 料液比对上清液吸光度的影响

2.1.3 提取时间对浸提马铃薯蛋白质后离心上清液吸光度的影响

在酸性和碱性条件下，提取时间对提取率的影响不是特别大，提取时间在0.5～1.5 h区间时，提取率升高比较明显，1.5 h之后较为缓慢，逐渐趋于平稳，如图4所示.考虑到企业生产效益，因此选取提取时间1 h左右进行提取比较适宜.

图4 提取时间对上清液吸光度的影响

2.2 马铃薯蛋白质在酸性条件下提取蛋白质正交实验的结果

由表3可得，酸性条件下，等电点提取马铃薯蛋白质的最佳提取条件为A2B2C1，显著性：A＞C＞B.说明pH值对马铃薯蛋白质提取的影响最大.在最优的提取条件下马铃薯蛋白质的提取率为74.3%.

表3 酸性条件下正交实验结果分析

2.3 马铃薯蛋白质在碱性条件下提取蛋白质正交实验的结果

通过表4可知，碱性条件下，等电点提取马铃薯蛋白质的最佳提取条件为A2B2C1，显著性：A＞C＞B.说明pH值对马铃薯蛋白质提取的影响最大.此时在最优提取条件下马铃薯蛋白质的提取率为11.6%.通过上述研究表明，影响马铃薯蛋白质提取率的因素显著（R）值得次序为：pH＞液料比＞时间，其中以pH值对提取率影响较为显著.另酸性条件下蛋白质提取率最大为74.3%，碱性条件下马铃薯蛋白质最大提取率为11.6%.证明在酸性等电点条件下马铃薯沉淀量较大，马铃薯含有的大部分蛋白质是碱溶性蛋白质.通过优化提取条件，在液料比2∶1、酸碱等电点分别作用下，提取1 h，总的蛋白质提取率为85.9%.

表4 碱性条件下正交实验结果

2.4 马铃薯蛋白质分子量的测定

2.4.1 酸性条件下马铃薯蛋白质色谱分析结果

在490 nm下根据凝胶层析的原理和通过标准葡萄糖公式的计算出峰值的含聚多糖量，可以确定3个标准聚多糖的峰值，如图5所示.由于分子量越小在分析柱流动越慢，流出来也越晚，所以的分子量小的标准品损失也越多，因此越晚流出来的标准品，波峰相对越低.查找资料可得马铃薯中存在3种蛋白质，其分子量分别为1.8×104，4.0×104，7.8×104［7］.在280 nm下，通过测定蛋白质吸光度，发现在酸性提取条件下，只有一种蛋白质，根据3种标准聚多糖的波峰和分子量，通过马铃薯蛋白质出现的波峰管位位置，可判断其分子量为4.0×104左右.

图5 酸提碱溶条件下洗脱液的测量曲线

2.4.2 碱性条件下提取马铃薯蛋白质色谱分析结果

根据凝胶层析的原理和通过标准葡萄糖公式的计算出峰值的含聚多糖量，可以确定3个标准聚多糖的峰值，如图6所示.由于分子量越小在分析柱中流动越慢，滞留时间越长，所以的分子量小的标准品扩散波峰越宽，因此越晚流出来的标准品，波峰值相对越低.与图5相比较，酸性条件下，标准聚多糖和马铃薯蛋白质出现的波峰的位置比碱性条件下晚一个管位洗脱液体积.在280 nm下，通过测定蛋白质吸光度，并由此计算蛋白质分子量.研究过程中发现3个峰，2个波峰分别代表2种酸溶性蛋白质，根据其波峰的位置可判断它们的分子量分别为1.8×104，7.8×104.表明马铃薯含有2种酸溶性蛋白质.其中分子量为4.0×104的蛋白质峰值很小，可能在pH=3.5时，分子量4.0×104的蛋白质没有完全沉淀下来，在酸溶液中还有一定溶解度，在调pH值过程中分子量4.0×104的蛋白质所带电荷在（pH＞3.5）条件下为负，与分子量分别为1.8×104，7.8×104的蛋白质带正电荷（pH＜8.5）产生聚沉效应，导致酸溶性碱沉蛋白凝胶层析有分子量4.0×104蛋白质小波峰出现.以上凝胶层析的实验结果和舒群芳等的实验结果一致［7］.分子量4.0×104蛋白质在pH8.5参与的聚沉效应很可能使调pH值从3.5 到8.5 的两步沉淀方法的蛋白质的提取率高于分别调pH值3.5和8.5的提取率加和85.9%，后续实验将对两步沉淀方法提取蛋白质得率进一步进行验证试验，为两步沉淀方法提供实验依据.

图6 碱提酸溶条件下下洗脱液的测量曲线

3 结论

本文通过单因素试验和正交试验的结果可知马铃薯蛋白质的最佳提取工艺：pH=3.5，液料比=2∶1，提取时间为1 h和pH=8.5，液料比=2∶1，提取时间为1 h，影响马铃薯蛋白质提取率的因素显著（R）值得次序为：pH＞液料比＞时间.在酸性、碱性等电点的分别作用下，可以使马铃薯蛋白质的提取率达到85.9%.如果采用中和调pH值两步沉淀法可能进一步提高蛋白质的提取率（＞85.9%），此方法在实际食品工厂生产中也具有一定的可操作性，但后续废液排放前要增加脱盐处理工序.通过本实验能够很明显的发现这3种蛋白质的存在，并且通过不同pH下的蛋白质吸光度和洗脱液稀释度的比较计算，确定酸性等电点pH=3.5的情况下主要沉淀出一种蛋白质（碱溶性蛋白），其分子量为4.0×104.碱性等电点pH=8.5的情况下主要沉淀出2种蛋白质（酸溶性蛋白），其分子量分别为1.8×104，7.8×104.通过这种方法对马铃薯含有的3种蛋白质进行分类.弥补了对马铃薯蛋白质研究的不足，从而为以后研究开发马铃薯蛋白质的保健功能和其在食品加工中充分的利用提供了参考.