饲料铜水平对黄鳝肝脏生化指标及肝脏、肠道组织结构的影响

2021-01-08姜文灏隗黎丽王自蕊周秋白

江西农业大学学报 2020年6期

王颖，刘瑜，高淼，姜文灏，隗黎丽，王自蕊，周秋白*

（1.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045；2.广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088）

【研究意义】铜通过参与构成含铜酶及蛋白在机体内发挥多种重要的生理功能，是鱼类所必需的微量营养元素之一。铜作为重金属元素，除具备营养作用外还具有较强的毒性，过量铜可通过芬顿反应产生大量自由基，进而造成蛋白质、脂质过氧化及DNA损伤[1]。肠道和肝脏是鱼类吸收利用饲料营养元素的主要器官，饲料营养组成的差异可造成鱼类消化器官结构及功能发生改变[2]。【前人研究进展】据报道，中间铜水平（3.75 mg/kg、5.25 mg/kg）饲料能够提升草鱼（Ctenopharyngodon idelus）肝胰腺抗氧化性能、保护肝胰腺，而当饲粮铜水平高于5.25 mg/kg时，草鱼肝胰腺抗氧化性能降低[3]。吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝脏中SOD和CuZn−SOD的活性随饲料铜水平的提高表现出先升高后降低的趋势，并且铜的添加量超过300 mg/kg会使其肝胰腺等组织结构和功能损伤[4]。当饲料中铜浓度≥506.9 mg/kg时，异育银鲫（Carassiusauratus gibelio）和斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）的肝脏与对照组相比内质网有扩张的现象[5]。【本研究切入点】黄鳝（Monopterus albus）是我国重要的水产养殖品种[6]，其营养需求研究已取得诸多成果[7−8]，但饲料铜对黄鳝肝脏、肠道结构和功能的影响目前未见报道。【拟解决的关键问题】本试验以黄鳝为对象，以摄食不同铜水平饲料黄鳝的肝脏生化指标及肝脏、肠道组织结构的变化来探究饲料铜对黄鳝组织的影响，以期为不同铜水平饲料对黄鳝组织的影响提供理论依据，为饲料中铜添加量的确定提供有用的信息。

1 材料与方法

1.1 试验设计及材料

于江西农业大学水产养殖基地挑选体质健康、无病无伤、活力较佳，均质量为（62.09±1.07）g的黄鳝用作试验，共600尾。试验共分为5组，每组4个重复，每个重复放置黄鳝30尾。养殖箱为88 cm×66 cm×64 cm蓝色塑料箱，在养殖箱内放置水葫芦，试验开始前7 d消毒，养殖用水为曝气自来水。试验采用分析纯五水硫酸铜（CuSO4·5H2O，西陇科学股份有限公司）作为饲料铜源，其余饲料原料购置于江西大佑农生物科技有限公司。试验饲料采用相同的营养配方及原料制备，所有原料均粉碎过80目。为使试验饲料铜水平涵盖低铜至高铜，以等对数间距（Log10）设计饲料铜添加梯度，在基础饲料中分别添加0，10，36.8，135.7，500 mg/kg含量的Cu2+，5组（CL1、CL2、CL3、CL4、CL5）饲料Cu2+实测值分别为14.21，23.95，37.01，135.63，499.63 mg/kg。制粒时先将五水硫酸铜加入预混合饲料充分混匀，在逐级混匀所有原料后调质制粒。试验饲料原料组成及营养成分见表1。

表1 试验饲料原料组成及营养水平（干物质）Tab.1 Raw material composition and nutrient levels of experimental feed（DM basis）

1.2 养殖管理

试验养殖工作在江西农业大学水产养殖基地进行，养殖试验期共60 d。正式试验开始前，暂养3周并饲喂对照组饲料进行训食。养殖期间，每2～3 d换水1/2，以保证养殖水质良好（pH=7.6±0.5；溶解氧>6.0 mg/L；NH4+−N<0.3 mg/L；NO2−−N<0.1 mg/L），自然水温（21～30 ℃），使水葫芦覆盖2/3水面。每日18:00投饵一次，每次投饵将饲料投置于同一位置，先投喂部分饲料，根据黄鳝吃食状况酌情补料，使饲料全部吃完。

1.3 样品采集

试验取样前停食1 d，对每个养殖箱黄鳝进行称量计数，生长数据见表2。采用60 mg/L的MS222麻醉10 min，每箱随机选取3尾黄鳝进行采血，以保证血液尽可能少的残存在内脏中，随后在无菌工作台上低温解剖。其中2尾取肝脏、肠道组织浸泡于4%多聚甲醛溶液（赛维尔），24 h换液一次，用于制备HE染色切片；并取肝组织浸泡于2.5%戊二醛溶液（赛维尔），24 h换液一次，4 ℃放置备用，用于制备肝脏透射电镜切片。剩余1尾取肝组织样品，将样品放置于无菌1.5 mL EP管中，液氮速冻后转移至−80 ℃超低温冰箱保存，用于测定肝脏生化指标。

表2 饲料铜水平对黄鳝生长性能的影响Tab.2 Effect of dietary copper level on growth performance of Swamp eels

1.4 测定方法

饲料中铜含量测定方法参照GB 5009.13—2017中第二法（火焰原子吸收光谱法），采用湿法消解进行样品前处理，原子吸收器型号为TAS−990A（北京普析通用仪器有限责任公司）。肝、肠经4%多聚甲醛固定后，脱水透明、浸蜡包埋、切片与贴片、脱蜡、染色、乙醇梯度脱水透明和封固来完成HE切片的制备，肝经2.5%戊二醛溶液固定后，漂洗、锇酸固定、再漂洗、乙醇梯度脱水、渗透、包埋、超薄切片和正染色来完成投射电镜切片的制备，HE染色切片及肝组织透射电镜切片均送至武汉塞维尔生物科技有限公司完成制备。肝组织生化指标测定试剂盒购置于南京建成生物工程研究所，严格按照试剂盒的说明书对丙二醛（MDA）含量（TBA法），超氧化物歧化酶（T−SOD）（WST−1法）、铜锌超氧化物歧化酶（Cu−ZnSOD）（羟胺法）、过氧化氢酶（CAT）活力（可见光法）及乳酸脱氢酶（LDH）（微板法）活力进行测定，高速组织研磨仪（武汉塞维尔，KZ−II）、分光光度计（上海箐华，755B型）、酶标仪（赛默飞）、恒温水浴箱（郑州市亚荣仪器有限公司HH−ZK4）、高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司3H20RI型）、恒温干燥箱（金坛市宏华仪器厂101A−3型）、漩涡混匀仪（海门市其林贝尔，XW−80A）和微量移液器等为主要使用仪器。

1.5 数据分析

结果采用平均值±标准误（Mean±SE）表示，用SPSS 22.0进行单因素方差分析（one−way ANOVA），若组间差异显著，再用Duncan’s进行多重比较，显著水平为P＜0.05。

2 试验结果

2.1 饲料铜水平对黄鳝肝脏抗氧化能力的影响

饲料铜水平对黄鳝肝脏生化指标的影响如表3所示。CL3、CL4、CL5组SOD、Cu−ZnSOD活力显著高于CL1、CL2组（P<0.05）；CL4、CL5组LDH活力及MDA含量显著高于CL1、CL2、CL3组（P<0.05）；各组黄鳝肝脏CAT活力则无显著差异（P>0.05）。

表3 饲料铜水平对黄鳝肝脏抗氧化的影响Tab.3 Effect of dietary copper level on liver biochemical indexes of Swamp eels

2.2 饲料铜水平对黄鳝肝脏显微结构和超显微结构的影响

饲料铜水平对黄鳝肝脏显微结构的影响如图1所示。5组黄鳝肝脏均存在不同程度损伤，其中CL1、CL2、CL3组肝脏结构相对于CL4、CL5组更为完善，表现为：肝小叶结构明显，肝细胞间界限更为清晰、核仁明显，细胞核大多分布在细胞中心区域。CL4、CL5组肝脏细胞分布散乱、细胞间限不清晰，肝细胞肿胀、细胞核偏移，出现大量无核肝细胞，伴有肝细胞空泡、破裂现象。

图1 饲料铜水平对黄鳝肝脏显微结构的影响，H E染色，放大倍数×400Fig.1 Effects of dietary copper level on liver microstructure of Swamp eels，H E staining，magnification×400

饲料铜水平对黄鳝肝脏超微结构的影响如图2所示。CL1、CL2、CL3 3组黄鳝肝脏细胞结构较为完善，核膜完整、清晰可见；细胞核周围分布有大量结构完整的粗面内质网，并以片层状排列；细胞核与内质网周边分布有不同数量结构完整的线粒体，其中CL3铜水平组线粒体数量最多；溶酶体数量及大小相对正常。CL4组内质网呈断裂不连续状态游离分布在细胞核外侧；溶酶体体积增大、数量增加，内部可见被吞噬的细胞器，CL5组内质网卷曲破裂、分布散乱，线粒体肿胀破碎，细胞质基质中可见大量脂滴。

图2 饲料铜水平对黄鳝肝脏超微结构的影响Fig.2 Effect of dietary copper level on liver ultrastructure of Swamp eels

2.3 饲料铜水平对黄鳝肠道显微结构的影响

饲料铜水平对黄鳝肠道显微结构的影响如图3所示。各组黄鳝肠绒毛均存在一定程度损伤，表现为肠绒毛披膜受损不平，绒毛内结缔组织分离；其中以CL5组黄鳝肠绒毛内结缔组织分离情况最为严重。CL1、CL2、CL3组肠绒毛杯状细胞数量相对稳定，CL4、CL5组肠绒毛杯状细胞数量急剧增加。

图3 饲料铜水平对黄鳝肠道显微结构的影响，H E染色，放大倍数×400Fig.3 Effects of dietary copper level on intestinal microstructure of Swamp eels，H E staining，magnification×400

3 讨论与分析

3.1 饲料铜水平对黄鳝肝脏生化指标的影响

与肝脏氧化损伤相关指标的变化可用于衡量鱼类受饲料重金属胁迫程度[9]。SOD是机体抗氧化系统重要组成，其通过歧化反应高效的消除超氧自由基，进而避免机体氧化损伤[10]。SOD为金属酶，可根据辅基和分布区域的不同而分为：Cu−Zn SOD、Mn SOD及胞外SOD（EC−SOD）[11]，并以Cu−Zn SOD为主要类型。本试验中，黄鳝肝脏Cu−Zn SOD、T−SOD活力在CL3组开始显著上升，表明摄入充足的铜元素能够促进黄鳝肝脏抗氧化能力提升。铜是Cu−Zn SOD主要构成元素之一，铜元素摄入不足可导致Cu−Zn SOD合成受阻，这可能是本试验中CL1、CL2组黄鳝肝脏抗氧化能力更低的原因[12]。同样，在俄罗斯鲟（Acipenser gueldenstaedti）[12]、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[13]和斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）[14]的研究上也发现，饲料中补充铜能够提升肝脏Cu−Zn SOD和T−SOD活力。

MDA是生物膜过氧化产物之一，能够与脂类、蛋白质及核酸等生物大分子交联进而破坏细胞膜结构[4]，其含量高低可有效反映细胞脂质过氧化程度[15]。本试验中，高铜组（CL4、CL5）组MDA含量显著升高，表明高铜饲料会加重肝脏氧化损伤程度。与本试验结果类似，吉富罗非鱼在摄食铜水平低于300 mg/kg的饲料时肝脏MDA含量无显著变化，当饲料铜水平达到1 057.29 mg/kg时肝脏MDA含量显著上升[4]。

LDH是糖代谢过程中的关键酶，参与丙酮酸与乳酸的转变过程，一般存在于细胞基质中，能够在一定程度上反映机体能量代谢状况[16]。研究表明，Cu2+与能量代谢过程密切相关。李艳纯等[17]认为细胞内Cu2+过量可抑制线粒体内铁硫簇的组装，造成铁硫蛋白功能损伤，从而影响三羧酸循环及氧化磷酸化过程，最终造成线粒体能量代谢的异常。Bottje等[18]及Iqbal等[19]认为Cu2+因芬顿反应产生的自由基会造成线粒体内膜脂蛋白和DNA严重损伤，引起线粒体功能受阻，无法合成充足的ATP用以自身修复或再生，损伤线粒体呼吸链功能。本试验中，高铜组黄鳝肝脏LDH活力显著上升，表明高铜饲料胁迫下黄鳝肝脏能量代谢方式发生改变。

3.2 饲料铜水平对黄鳝肝脏显微结构和超显微结构的影响

肝脏是鱼类主要的营养代谢器官及解毒器官，饲料铜水平与肝脏组织结构与功能密切相关。崔欣[4]研究发现高铜饲料造成吉富罗非鱼肝脏脂肪变性，最终导致肝细胞肿胀、细胞膜界限模糊；种香玉[5]研究发现高铜饲料引起异育银鲫和斑点叉尾鮰肝细胞内质网扩张、线粒体肿胀凋亡。本试验中，低铜组黄鳝肝脏损伤程度小、细胞器结构清晰完整，高铜组黄鳝肝脏损伤严重、细胞器结构破碎，大量肝细胞溶解死亡，表明高铜饲料可造成黄鳝肝脏损伤。这可能是铜在肝脏中过度蓄积，产生大量自由基引起细胞生物膜脂质过氧化所导致。

铜在脂代谢过程中具有改性剂的作用，与鱼类脂肪代谢及沉积关系密切[20]。宋玉峰[20]研究发现高铜饲料会诱导黄颡鱼体内发生内质网应激（ER Stress），进而引起脂类代谢基因表达下调，导致脂类在细胞内沉积，这可能是本试验中CL5组肝细胞内脂滴大量沉积的原因。

3.3 饲料铜水平对黄鳝肠道显微结构的影响

肠道是鱼类对饲料营养成分进行消化吸收的主要器官，饲料营养与动物肠道的结构、肠黏膜的生长修复及生理功能密切相关[21]。种香玉[5]研究发现，高铜（1 491.1 mg/kg）饲料造成异育银鲫和斑点叉尾鮰肠绒毛排布凌乱、柱状细胞空隙增大。本试验中，高铜组黄鳝肠绒毛损伤更为严重，并伴有肠绒毛杯状细胞数量急剧增加，表明高铜饲料会造成黄鳝肠道结构及功能受损。研究表明，肠道有助于缓冲鱼类对饲料铜的吸收[22−23]，杯状细胞分泌黏液蛋白所构成的肠黏液屏障对肠道具有保护作用[24]。Handy等[25]研究发现黏液覆盖在肠道表面能够将游离Cu2+络合成蓝色沉淀，进而降低铜对肠道损伤；其将肠囊外翻放置于不同铜浓度的生理盐水培养基中，发现增加铜浓度能够刺激肠囊分泌黏液。此外，肠粘膜受损时杯状细胞分泌的三叶状蛋白能够促进受损上皮细胞修复[26]。因此在本试验中，黄鳝肠道黏液细胞数量增加可能是黄鳝对高铜饲料的一种防御及自身修复机制。黄鳝在机体摄入铜过量时为降低肠道对铜的吸收，通过增加杯状细胞数量来提升黏液分泌量，进而提升对饲料铜的屏障能力。