蔬菜根结线虫生防放线菌LY4的筛选及其鉴定

张 琦，申 帅，胡先奇*

（1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201；2.云南农业大学植物保护学院，云南昆明 650201）

【研究意义】植物根结线虫是世界范围内主要的农业害虫，主要寄生于植物的根部组织，据统计，全球每年因植物根结线虫造成的直接经济损失就高达1 570亿美元[1]，世界农业平均减产24.5%[2]。植物根结线虫不仅能通过分泌物感染寄主，而且还能为其他病原微生物的感染打开通道，引起继发病害。化学防治一直作为根结线虫防治的主要手段，但其带来的对环境的严重破坏，其残留物对人畜的毒害等副作用也日益凸显。而抗病品种的应用目前并不广泛；作物轮作的方法对发展中国家和人口众多的国家来讲，粮食需求量巨大，务农者经济收入降低等因素并未广泛应用[3]。所以近年来，生物防治手段因低毒、高效、人畜无害、环境友好的优点，其探索日益发展迅速。【前人研究进展】微生物是植物根结线虫生物防治剂丰富的天然来源，放线菌在防治植物寄生线虫中起重要作用，Rashad等[4]从20份土壤样品中分离出了29株具有杀线活性的链霉菌。陈井升等[5]从大豆根际土壤中分离出了具有杀线活性的链霉菌S.par⁃vusH−2。Kaur等[6]报道了一种来自氢链霉菌菌株DH16的新型抗真菌化合物，该菌株发酵液上清液具有较强的杀线虫活性。金娜等[7]发现红灰链霉菌HDZ−9−47在田间施用时可有效地防治南方根结线虫病。Manish等[8]报道了具有杀线虫活性链霉菌菌株M7。Ruanpanun等[9]报道了链霉菌属CMU−M021产生两种抗真菌化合物，其中化合物Fervenuline对二龄幼虫具有较高的致死率。胡梦君[10]报道了放线菌菌株1331发酵液可有效地抑杀南方根结线虫，并在温室盆栽试验中取得了较好的防治效果。焉小宁等[11]分离得到对南方根结线虫具有较高生物活性的玫瑰暗黄链霉菌。周银丽等[12]报道了淡紫灰链霉菌MZ11不但对石榴枯萎病菌具有较好的室内拮抗作用，其50%浓度的发酵液对南方根结线虫卵孵化也具有较好的抑制效果。

【本研究切入点】到目前为止，已经陆续发现很多对根结线虫具有较好抑制活性的放线菌，但是大部分生防菌的研究仍停滞在实验室研究阶段，只有为数不多的生物防治剂被商业化并在该领域大规模应用[13]。生物防治剂能否成功应用的关键制约因素是它们在各种环境条件下的作用性能能否保持稳定[14]。【拟解决的关键问题】本试验以云南农业大学农场、昆明捞鱼河湿地公园以及云南省陆良县土样中分离出的101株放线菌为筛选对象，通过其发酵液上清液及土壤稳定性试验筛选用于防治南方根结线虫病的生防菌，以期为南方根结线虫病的防治拓宽新的生防菌资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品 采自云南农业大学农场、昆明捞鱼河湿地公园、云南省陆良县土壤样本。选取每块田地的四角位置和中间位置为采集点。采集时，在植株周围选3处不同位置用铁铲挖至10～15 cm处，每个位置取100 g左右的土壤去除肉眼可见较大明显的石块或者腐质，然后装至无菌自封袋中，混合均匀，带回实验室后去杂和过筛处理[12]。

1.1.2 培养基 放线菌分离培养基：放线菌的分离采用高氏合成1号琼脂培养基。放线菌发酵培养基：高氏合成1号液体培养基。

1.1.3 供试线虫 南方根结线虫（Meloidogyne incognita）：来自云南农业大学线虫实验室。

1.1.4 供试植株和药剂 空心菜：云南农业大学线虫实验室保存。1%阿维菌素颗粒：山东省绿士农药有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 放线菌的分离和纯化 放线菌的分离采用稀释涂布平板法[15]。放线菌的纯化：在培养的第7天挑取单菌落至高氏1号固体培养基上划线纯化，将纯化后的培养基置于28 ℃培养箱中培养7 d后，挑取单菌落，再度在高氏1号固体培养基上划线纯化。然后挑取纯化好的单菌落接种于高氏合成1号固体培养基上，28 ℃下培养并编号。

分离、纯化共获得放线菌101株。分别来自云南农业大学试验田编号为YN1～YN30，昆明捞鱼河湿地公园编号为LY1～LY47，云南省陆良县编号为LP1～LP22、JG1～JG4、GT6。

1.2.2 二龄幼虫虫悬液的制备 将收集挑取的卵块放在消毒过的中性滤纸上，置于消毒过的网筛上，再将网筛放置在盛有无菌水的培养皿中，使水刚好浸湿滤纸，然后一起放到28 ℃培养箱中孵化，每12 h收集一次线虫于敞口的烧杯中（烧杯中浅水即可）。放于4 ℃冰箱保存备用（切勿水干）。

1.2.3 根结线虫生防菌的初步筛选 （1）放线菌发酵液的制备：因所要发酵的菌种较多所以选用50 mL的离心管作为发酵容器，每管装30 mL经灭菌过的高氏合成1号液体培养基[16]。然后用接种针挑取纯化后的菌丝于液体培养基中，180 r/min，28 ℃条件下振荡培养96 h。（2）发酵液对二龄幼虫的影响：将发酵液在8 000 r/min离心5 min，取上清液3 mL到直径6 cm的小培养皿中。再将无菌水冲洗过的线虫加入培养皿中，定容线虫浓度为30条/mL（每皿100条左右），以无菌水作为对照组，3次重复。放入28 ℃恒温箱中24 h之后镜检各处理线虫的死亡率并计算校正死亡率。僵直不动，用牙签或挑针戳动仍然僵直无活性的判为死亡。计算线虫死亡率和校正死亡率公式为[17]：

1.2.4 根结线虫生防菌的进一步筛选 经初筛后，选取具有高效杀线活性的放线菌发酵液进行进一步复筛，按1.2.3步骤发酵液离心后，取上清液稀释1.25倍、2倍和5倍，分别测试对二龄幼虫的击倒率，以清水为对照组，3次重复，24，48，72 h后镜检记录。

1.2.5 土壤稳定性试验 取颗粒饱满的空心菜种子，先用2%的次氯酸钠溶液浸泡消毒10 min。然后，用无菌水多次冲洗干净，再放置清水中浸泡过夜，第二天将种子放在湿润的中性滤纸上，置于培养皿中，28 ℃恒温箱黑暗培养催芽。

边长7 cm、高度8 cm的小盆中分别装入灭菌土，灭菌土比例按m（红土）∶m（腐殖土）=3∶1配置。将发芽的种子移栽自盆中，每盆一株，温室培养10 d后，每盆用30 mL的发酵液原液灌根，灌根后，即接入线虫，每株400头左右。以1%阿维菌素为标准对照组，清水为空白对照组。1%阿维菌素对照组采用颗粒剂与灭菌土混匀回填的方式施药[10]，施药剂量约为500 mg/kg。每组5次重复，30 d后随机处理3个重复，观察统计根结数量，统计根结百分比率，分析病害级别，计算病情指数和防治效果。

根结百分比率（%）：根系中的根结占整个根系的比例（目测，估计）。

根结线虫分级标准参照Hartman[18]的方法。0级：根系完整，无根结；1级：仅有少量根结，根结百分比率小于1/4；3级：根结百分比率为1/4～1/3；5级：根结形成中等数量，根结百分比率为1/3～1/2；7级；根结数量较多，根结百分比率大于1/2；9级：根部长满根结。

1.2.6 生防菌LY4的鉴定 培养特征：将放线菌菌株LY4分别接种到高氏合成1号琼脂培养基、无机盐淀粉培养基、甘油−天门冬酰胺培养基、酵母膏−麦芽糖琼脂培养基、酪氨酸琼脂培养基、PDA培养基、葡萄糖硝酸盐培养基、察氏培养基上，28 ℃培养7～15 d。借鉴参考文献[19−20]的方法，观察菌株气丝、基内菌丝在各种培养基上的形态特征、颜色，有无可溶性色素及生长等情况。

生理生化鉴定借鉴参考文献[20]的方法。（1）明胶液化。将菌种穿刺接种到明胶液化培养基，28 ℃培养7～15 d观察其液化情况。观察前先将菌种管放置4 ℃冰箱中冷藏20～30 min。若明胶仍是固体，则不液化；若有液体，则明胶液化。（2）酪氨酸水解。将菌种接种到酪氨酸琼脂培养基上，28 ℃培养7～15 d，观察是否有黑色素产生。若有黑色素产生，说明菌株具有酪氨酸酶。（3）硫化氢生成。将菌种穿刺接种到硫酸亚铁琼脂培养基上，28 ℃培养7～15 d观察是否有黑褐色色素产生。若有，则有H2S产生，H2S与柠檬酸铁生成黑色硫化铁。（4）纤维素上生长。将菌种接种到纤维素刚果红培养基上，28 ℃下培养7 d，观察菌株生长情况。若菌株正常生长则能利用纤维素，若无法生长，则不能利用纤维素。（5）碳源利用。不同放线菌利用不同碳源的能力差异很大。将菌株接种到不同碳源的培养基上观察其生长状况。若菌落生长表明可利用该碳源，反之则不能利用该碳源。

1.2.7 菌株LY4的分子鉴定 DNA的提取，借鉴饱和酚法[21]。16S rDNA的PCR的扩增：采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增。

PCR反应体系：2×PowerTaqPCR MasterMIX 12.5µL，上游引物1µL，下游引物1µL，模板DNA 2µL，ddH2O 8.5µL，总体积25µL。

测序及分析：将呈阳性的菌液送至生工生物工程股份有限公司进行测序，所得序列用BLAST在Gen-Bank中进行同源性对比，再用MEGA6.0软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 根结线虫生防菌的初步筛选

从云南农业大学农场、昆明捞鱼河湿地公园采集和云南省陆良县采集的土壤样本中，分离到101株菌落特征各不相同的放线菌，通过发酵液原液上清液的初步筛选获得3株防效高于90%的放线菌菌株LY4、LY8和GT6。

2.2 根结线虫生防菌的进一步筛选

24，48，72 h后，3株放线菌的发酵上清液在3种不同浓度的稀释倍数下对南方根结线虫都有抑杀作用。3株放线菌发酵上清液在1.25倍稀释倍数下，处理南方根结线虫48 h后的的校正死亡率都能达到100%；在5倍的稀释条件下，处理南方根结线虫72 h后的校正死亡率都能达到70%以上，其中菌株GT6效果最好，达92.60%，与菌株LY4、LY8差异显著（表1）。

30 d后各植株的防治效果如表2，可以看出，防效最好的是LY4，而在离体生测试验中效果最好的GT6在盆栽试验中防治效果反而并不突出。

2.3 生防菌LY4的鉴定

2.3.1 形态和培养特征 在高氏合成1号琼脂培养基上气生菌丝为白色、较薄，菌落表面干燥、绒状，凸起。基丝粉红色略显淡紫色，有紫色可溶性色素。孢子丝直，孢子椭圆形，表面光滑（图1）。放线菌LY4在各种鉴定培养基上的培养特征（表3）。

2.3.2 生理生化特征 放线菌菌株LY4能利用蔗糖、D−棉子糖、D−半乳糖、肌醇、D−甘露糖，不能利用D−木糖、D−果糖、L−鼠李糖、D−阿拉伯糖。明胶液化，不产类黑色素和H2S，不能利用纤维素（表4）。

2.3.3 16S rDNA序列测定及系统发育树分析 用提取的DNA为模板，细菌通用引物27F、1492R为引物进行PCR扩增，放线菌LY4的16S rDNA扩增产物大小1 500 bp左右（图2）。

表1 3株放线菌的发酵上清液在3种不同浓度的稀释倍数下对南方根结线虫抑杀作用Tab.1 Antifungal effect of fermentation supernatants of three actinomycetes on southern root-knot nematodes at three different concentrations

表2 土壤稳定试验（30 d）Tab.2 Soil stability test

图1 菌株LY4的显微照片（400×）Fig.1 The microscopy morphology of the strain LY4（400×）

表3 放线菌LY4在各种鉴定培养基上的培养特征Tab.3 Culture characteristics of actinomycetes strains LY4 in different media

表4 菌株LY4的生理生化特征Tab.4 Physiological and biochemical characteristics of strain LY4

PCR产物的回收与纯化及分子克隆测序获得的菌株LY4的16S rDNA序列1 469 bp，与GenBank中相关序列进行Blast相似性对比，放线菌菌株LY4与淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）的16S rDNA序列同源性为99.05%，建立系统发育树（图3）与淡紫灰链霉菌（D85114.1）处于同一分支。结合形态特征、生理生化特征以及系统发育树的分析，初步将放线菌菌株LY4鉴定为淡紫灰链霉菌。

3 结论与讨论

本研究以土壤中分离、筛选出的101株放线菌菌株为对象，经初步筛选得到3株对南方根结线虫致死率高于90%的放线菌菌株：LY4、LY8和GT6。LY4、LY8和GT6发酵液原液稀释2倍和5倍的条件下处理南方根结线虫二龄幼虫72 h的校正死亡率分别为99.64%、98.67%、100.00%和78.85%、73.16%、92.60%，在土壤稳定性试验中，3组防效差异显著，LY4相较于LY8组和GT6组，防效最好，防效为71.10%。结合菌株LY4在鉴定培养基上的形态特征和培养特征、生理生化鉴定和16S rDNA的多项指标分析，初步将放线菌菌株LY4鉴定为淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）。

目前，关于放线菌对根结线虫致死效果和对卵孵化的抑制效果已有很多报到，大部分都集中在链霉菌属，例如：密旋链霉菌（S.pactum）和娄彻氏链霉菌（S.rochei）、针孢链霉菌（S.aculeolatus）、淡紫灰链霉菌MZ11、灰肉红链霉菌HA0701、红灰链霉菌HDZ−9−47等[19,22−23]。已经用于商业化的阿维菌素、尼克霉素等也是由链霉菌产生。本试验筛选出的放线菌发酵液原液对南方根结线虫二龄幼虫具有较高的致死率，其原因可能有两个方面：（1）次级代谢产物中具有杀线活性的物质使线虫受到毒害。（2）菌体或孢子本身对线虫具有寄生作用进而杀死线虫。目前，除虫链霉菌代谢产物中的大环内酯化合物已进行商业化开发，本试验中放线菌发酵液次级代谢产物的活性物质及对线虫的作用机制还需进一步探究。

图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 The 16S rDNA electrophoretogram of the LY4

图3 以16S rDNA为基础构建的LY4菌株系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of LY4 based on 16S rDNA sequence

在土壤稳定性试验中，菌株LY4的防效为71.10%，其效果好于玫瑰暗黄链霉菌的52.80%，推测可能是与灌根施加的发酵液原液的量有关。在离体生测试验中效果最好的是菌株GT6，但在土壤稳定性试验中表现却并不突出，所以在实验室内有良好抑制效果的菌株未必在土壤复杂的微生物环境中依然良好，而在实验室内抑制效果一般的菌株也可能在土壤复杂的微生物环境中表现良好。本试验所筛选出的放线菌菌株LY4虽然在体外生测试验和温室小盆栽试验中对根结线虫具有一定的防治作用，但在大田试验中是否有比较好的效果，还需进一步深入探究。