西瓜枯萎病生防细菌YZU-S8的筛选及其防病促生作用的研究

郑通文，蔡民政，刘 璐，孙正祥，周 燚

（长江大学农学院/湖北省农林病虫害预警与调控工程技术研究中心，湖北荆州 434025）

【研究意义】由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporumf.sp.niveum，FON）侵染引起的西瓜枯萎病是一种世界性土传病害，于1894年Smith首次报道，现已分布于世界各地的西瓜种植区[1−3]。该病害的病原孢子在土壤中可存活10年之久[4]，且寄主广泛，给病害的控制带来严重困难。目前防治西瓜枯萎病的方法主要有农业防治、抗病育种和化学防治[5]。农业防治简单有效但费时费力；选育抗病品种周期长、难度大；化学农药导致病菌产生抗药性，且造成环境污染。利用植物有益生防菌进行生物防治既环保经济又可持续，已经成为国内外学者研究的热点。【前人研究进展】目前报道的西瓜枯萎病生防菌主要有芽孢杆菌属（Bacillusspp.）和假单胞杆菌属（Pseudomonasspp.）[6]，如：解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefa⁃ciens）[7−8]、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）[9]。【本研究切入点】这些菌株具有良好的室内防效，但其田间防效稳定性不理想，难以推广应用[10]。因此，筛选更多更优质的生防资源具有重要的意义。【拟解决的关键问题】本研究从健康的油菜植株及根际分离筛选对西瓜枯萎病菌具有较强拮抗作用的细菌，测定其抑菌谱、盆栽防效和对西瓜植株的促生作用，以期为西瓜枯萎病的生物防治提供更多的菌源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试病原菌：西瓜枯萎病菌（FON）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄早疫病菌（Alternaria so⁃lani）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、白芨白绢病菌（Sclerotium rolfsii）、马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）和玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）均由本实验室分离与保存，棉花黄萎病菌（Verticillium dahliaeKleb）由中国农业科学院棉花研究所惠赠。

西瓜品种：西农8号，由原西北农业大学科研人员选育。培育西瓜所用的基质土为长江大学农学院自行研发的育苗专用基质土。供试培养基为马铃薯葡萄糖培养基（PDB）和营养肉汤培养基（NB）及相应的固体培养基[11]。

1.2 西瓜枯萎病拮抗菌株的分离纯化

以五点取样法，2019年从荆州12块油菜田采集长势良好的油菜植株，抖去根部大量土壤，用灭菌的毛刷轻轻刷下根际土（约0.5 mm厚度），将油菜植株和根际土分别装在采样袋中带回实验室，备用。根际细菌的分离：取10 g根际土，加入90 mL无菌水悬浮，获得10−1稀释液，依次梯度稀释，取适量的10−7，10−8，10−9稀释液涂布于NA平板[12]。油菜内生菌分离：称量1 g的油菜根组织，表面消毒后，充分研磨，梯度稀释，取适量的10−4，10−5，10−6稀释液涂布于NA平板。将上述的NA平板置于28°C培养箱中，48 h后挑取颜色、光泽、边缘光滑度和厚度不同的单菌落于新的NA平板上进行划线培养，所得菌株斜面保存，备用。

1.3 西瓜枯萎病拮抗菌株的初筛

采用平板对峙法[13]，将病原菌（FON）菌饼接种至PDA平板中央，在平板两侧距平板中央各2.5 cm的地方平行划线接种待测细菌，于28 ℃培养箱中培养。每个处理3次重复，4 d后测量各处理的抑菌带大小。

1.4 西瓜枯萎病拮抗菌株的复筛

将初筛的菌株分别接种于NB中，于28°C、130 r/min的摇床上培养48 h。在PDA平板中央接种培养72 h的西瓜枯萎病菌菌饼（直径6 mm），用无菌的打孔器在距离中央2 cm处三点对称打孔，每孔中分别注入100µL待测菌株的菌液，以接种等体积的NB为对照，每个处理3次重复，平板置于28 ℃恒温培养箱中培养，待对照平板中西瓜枯萎病菌菌丝即将长满全皿时，测量各处理组的抑菌带大小。

1.5 菌株YZU-S8抑菌谱的测定

参照Jeong等[14]并稍作改进，制备YZU−S8的无菌滤液，将无菌滤液混入冷却至55 ℃左右的PDA中，使其终浓度分别为5%、10%和20%，倒成平板。以混入相同体积的NB为对照。在PDA平板中央接入待测病原菌菌饼，28 ℃倒置培养。每处理4次重复。待对照组菌丝几乎长满培养皿时，测量各组的菌落直径，计算相对抑制率[15]。

1.6 YZU-S8对西瓜枯萎病的盆栽防效测定

挑取健康、饱满的西瓜种子，进行常规的播种处理[16]。待西瓜幼苗长出第3片真叶后，将其移栽至塑料盆中[17]。实验分为3个处理：（1）病原菌（FON）+提前3 d接种YZU−S8；（2）病原菌（FON）+同时接种YZU−S8；（3）病原菌（FON）+NB。

将FON接种到PDB中，28 ℃、130 r/min振荡培养5 d，所得菌液用无菌纱布过滤后得到分生孢子悬浮液，将其混入无菌基质土中制成病土（105个孢子/克）。制备YZU−S8悬浮液（108cfu/mL），接种时对西瓜幼苗进行灌根，每株接种30 mL。以接种等体积的NB为对照，每个处理15株西瓜苗，3次重复。西瓜植株均放置于（25±2）℃温室中培养，光照∶黑暗=12 h∶12 h。接种病原菌（FON）后21 d，参照王夏雯等[18]方法，调查西瓜植株的发病严重度和计算相应的病情指数、防效。

1.7 YZU-S8对西瓜植株的促生长测定

西瓜的种植、生防菌液的制备和接种同1.6。以接种等体积的NB为对照，每处理12株西瓜植株，3次重复。将西瓜植株放在（25±2）℃温室中培养，光照∶黑暗=12 h∶12 h，30 d后测量并记录西瓜植株的主蔓长、根长、鲜质量和叶绿体含量等指标。

1.8 YZU-S8的分子鉴定

使用OMEGA细菌基因组提取试剂盒提取YZU−S8的总DNA，采用16S rDNA基因通用引物（27F：5′−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3′和1492R：5′−GGTTACCTTGTTACGACTT−3′）[19]进行PCR扩增。反应体系：PCR StarMix 20 µL、正引物1.0 µL、反引物1.0 µL、DNA 2.0 µL和ddH2O 16 µL；扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 °C变性40 s、58 °C退火40 s、72 °C延伸60 s，变性、退火和延伸循环30次后于72 ℃继续延伸10 min。取少量PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物送至擎科新业生物技术有限公司测序。所得序列在NCBI的GenBank中进行比对分析，利用MEGA7.0软件构建系统发育进化树。

1.9 数据分析

采用SPSS 17.0进行Duncan’s多重比较，检验组间差异显著性，数据表示为平均数±标准差。

2 结果与分析

2.1 西瓜枯萎病拮抗菌株的分离和初筛

从油菜根及根际土样品中共分离得到内生细菌和根际细菌127株，经平板对峙初筛出17株对西瓜枯萎病菌有拮抗作用的细菌，其中70%为根际细菌（表1）。

表1 西瓜枯萎病拮抗细菌的分离和初筛Tab.1 Isolation and screening of biocontrol bacteria against watermelon Fusarium wilt

2.2 西瓜枯萎病拮抗菌株的复筛

拮抗菌株的复筛结果表明，抑菌带宽超过5 mm的菌株共有7株，其中内生细菌YZU−S8对西瓜枯萎病菌的抑制活性最强，形成的抑菌带宽达10 mm以上（表2），作为后续研究的菌株。

表2 西瓜枯萎病生防细菌的复筛Tab.2 Secondary screening of biocontrol bacteria against watermelon Fusarium wilt

2.3 菌株YZU-S8的抑菌谱测定

抑菌谱测定结果表明，YZU−S8的无菌滤液在不同浓度下对9种供试的病原菌均有抑制作用（表3），浓度为20%时其抑制率为40.35%～98.95%，其中对白芨白绢病菌的抑制率最高（98.95%）。

表3 菌株YZU-S8的抑菌谱测定Tab.3 Antifungal spectrum of YZU-S8

2.4 YZU-S8对西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽防效结果表明，只接种西瓜枯萎病菌的植株病情指数为81.33，而提前3 d和同时接种YZU−S8菌株的植株病情指数分别为21.33和40.00，相对防效分别为73.8%和50.8%（表4）。

表4 菌株YZU-S8对西瓜枯萎病的盆栽防效Tab.4 Control effect of YZU-S8 on watermelon Fusarium wilt in pot experiment

2.5 YZU-S8对西瓜植株的促生作用

促生试验结果表明，接种生防菌YZU−S8后30 d，西瓜植株长势与对照相比存在显著差异，其主蔓长和根长的增加量分别为8.01 cm和8.34 cm，地上鲜质量增加了6.88 g（表5）。

表5 YZU-S8对西瓜植株的促生作用Tab.5 Effect of YZU-S8 on the growth of watermelon plants

2.6 YZU-S8的分子鉴定

YZU−S8菌株的16S rDNA序列长度为1 381 bp，BLAST结果表明其与贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）S1−5−7的16S rDNA序列具有100%的相似度。系统发育进化树显示菌株YZU−S8与贝莱斯芽孢杆菌在同一分支上（图1），初步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。

图1 基于YZU−S8的16S rDNA序列及其相似序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA of YZU−S8 and its homologous sequences

3 讨论与结论

植物根际细菌和内生细菌通常在植物的生长发育和对病害的防御过程中起着重要的作用，在长期的进化中与植物之间建立了友好的共生关系，是植物病害生防菌剂的重要来源，具有巨大的开发价值[20−21]。国内外已经有许多关于植物根际细菌和内生细菌防治植物病害的报道[22−24]。为了拓宽西瓜枯萎病生防菌株的来源，获得更高效的拮抗菌，本研究从油菜根和根际分离筛选出一株对西瓜枯萎病菌具有显著抑制活性的内生菌株YZU−S8，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。YZU−S8的无菌滤液对病原真菌表现出了广谱的抑制作用，表明其可产生具有抑菌效果的活性代谢产物。然而，该菌株能合成的抑菌物质的成分尚不明确，需要进一步研究。

防病和促生是生防菌株应用于生产实践所必备的两大功能，也是筛选拮抗菌株的主要指标[25]。赵佳等[26]筛选得到的解淀粉芽孢杆菌Lh−1对西瓜枯萎病的盆栽防效为78.5%，且对西瓜植株具有显著的促生作用。在本研究中，菌株YZU−S8在盆栽实验中对西瓜枯萎病也表现出了良好的防效，且该菌株对西瓜植株具有显著的促生作用，使其蔓长、根长和鲜质量有了明显的增加，这有助于增强西瓜的抗病能力，进而降低西瓜枯萎病的发病率。因此，菌株YZU−S8在防治西瓜枯萎病方面具有良好的开发潜力。

生防菌的田间防效易受土壤条件、作物生长状况及根际生态系统等多种因素的影响，导致防效不稳定，严重阻碍了生防芽孢杆菌的推广应用[27]。此外，生防芽孢杆菌与病原微生物的竞争作用是其防治植物病害的重要作用机制之一[28]。因此，需要进一步研究菌株YZU−S8对西瓜枯萎病的田间防效和在西瓜植株上的定殖能力，为其研发应用提供更多的实践基础。