肿节风HPLC-MS 指纹图谱建立

邓 攀,董 文,黄素荣,刘旭海,刘 勇,陈小荣,朱明辉

(1.江中药业股份有限公司,江西 南昌 330004;2.江西中医药大学,江西 南昌 330004)

肿节风为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.) Nakai 的干燥全草[1],具有清热凉血、活血消斑、祛风通络的功效,可用于治疗上呼吸道感染、骨折等诸多疾病[2-3]。肿节风是江西特色道地药材,商品药材主要来源于野生草珊瑚资源,相关产品有复方草珊瑚含片、肿节风片以及肿节风注射液等[4-5]。《中国药典》 是目前国内各类中药材的主要质量检测依据,但对于大多数药材而言,《中国药典》 中的检验指标并不能全面反映药材的药用信息。长期以来对于中药基础化学研究的缺失,使得国人至今仍对诸多中药材的有效成分缺少了解,这直接影响了中药材的规范化质量控制,并有碍于我国中药产品走出国门[6]。

指纹图谱技术是目前国际公认的草药制剂质量控制技术[7],美国、英国、印度等国家和地区均将指纹图谱纳入其草药制剂质量控制范畴[8-9]。本研究在充分采集各产地肿节风代表性样品基础上,运用HPLC-MS 技术开展肿节风种源研究,建立双柱串联肿节风指纹图谱,并进行成分分析,以期进一步提升对对肿节风药材的质量把控能力。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪、Waters2998 二极管阵列检测器(美国Waters 公司)；KQ-500B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SECURA125-1CN 电子天平、SECURA224-1CN 电子天平[赛多利斯科学仪器(北京) 有限公司]；Millipore Direct-Q3UV 超纯水机(美国密理博公司)；标准药筛(绍兴市上虞张兴纱筛厂)；MSQ PLUS 质谱仪(美国Thermo Fisher 公司)。

1.2 试剂 对照品异嗪皮啶、肿节风药材、迷迭香酸、绿原酸,均购于中国食品药品检定研究院；质谱乙腈(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；色谱甲酸(山东西亚化学股份有限公司)；色谱甲醇、乙腈(美国霍尼韦尔公司)；水为超纯水。

1.3 药材 肿节风药材均经江西中医药大学刘勇老师鉴定为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai 的干燥全草。样品信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 双色谱柱,前柱Agilent 5HC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm),后柱Eclipse plus phenyl-Hexyl(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相0.1% 甲酸乙腈溶液(A) -0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱(0～15 min,15%A；15～60 min,15%～30%A；60～90 min,30%～60%A)；0～15 min,体积流量0.3 mL/min,其余时间体积流量0.5 mL/min；柱温30 ℃；检测波 长330 nm；进样量10 μL。

2.2 供试品溶液制备 精密称取肿节风药材粉末(过3 号筛) 1.0 g,置于50 mL 三角瓶中,加入10 mL 60% 甲醇,超声30 min,滤过,滤液经0.45 μm 有机微孔滤膜过滤,即得。

2.3 双柱串联模式确定 传统的液相分离过程通常选择单根短柱或单根长柱进行HPLC 分离,但组分分离过程效果不佳。本研究运用双柱串联模式开展各产地肿节风药材组分HPLC 分析结果见图1,双柱串联模式组分分离效果显著优于单根短柱及单根长柱HPLC 分离过程,双柱串联HPLC分离模式实现了肿节风药材各组分的极大化分离。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取肿节风药材,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次,得各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.25%,各共有峰相对峰面积RSD 均小于2.50%。表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取肿节风药材6 份,分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液6 份,在“2.1” 项色谱条件下进样,得各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.80%,各共有峰相对峰面积RSD 均小于3.00%。表明该方法重复性良好。

图1 双柱串联HPLC 分离结果比较

2.4.3 稳定性试验 取肿节风药材,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液1 份,在“2.1” 项色谱条件下,分别于制备后0、2、4、8、12、24 h 进样,测得各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.30%,各共有峰相对峰面积RSD 均小于2.50%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 肿节风药材指纹图谱

2.5.1 指纹图谱建立 对22 批不同产地样本进行HPLC分析,将各产地样品测试数据导入相似度评价系统软件中,选择S10 样品图谱作为参照指纹图谱,并以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法,同时结合多点校正法对各产地液相图谱进行匹配,结果见图2。

分析结果显示,各产地肿节风药材确认有10 个共有峰,见图3。结合HPLC-MS 图谱数据及对照品比对,确认了共有特征峰2、7、9 分别为绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸成分。HPLC 与MS 技术相结合,即使在不同实验时期HPLC 色谱峰出峰时间略有偏移,也可以通过MS 图谱确认参照峰,进而加以校正。

图2 22 批样品HPLC-MS 指纹图谱

图3 各成分HPLC-MS 对照指纹图谱

2.5.2 相似度分析 按照上述数据处理方式,相似度评价结果见表2,22 批不同产地样品的平均相似度为0.946,表明不同产地的肿节风样品色谱模式大致相似,其化学成分大致相同。

表2 22 批样品相似度

为评价肿节风药材指纹图谱在药材真伪鉴别方面的有效性,选用肿节风对照药材和鱼子兰(肿节风伪品) 进行比对。结果见图4,肿节风对照药材具备肿节风对照指纹图谱的10 个共有特征峰且相似度达0.925,而鱼子兰药材仅具有特征峰9 (迷迭香酸),与肿节风对照指纹图谱存在显著差异。表明,本研究建立的方法可以实现肿节风药材真伪鉴别。

2.5.3 聚类分析 鉴于肿节风指纹图谱信息的复杂性,运用SPSS 16.0 软件对图谱进行聚类分析[10]。将各产地肿节风共有特征峰导入SPSS 软件,运用组间连接法进行系统聚类分析,并采用欧氏距离进行样品间距离计算,结果见图5。当判别距离为25 时,S18～S20 号样品单独为一类C(四川),其他产地肿节风样品聚为一类。当判别距离为12时,剩余18 批肿节风可以分为A (福建、广东、浙江)、B (广西、江西、湖南、湖北、重庆、贵州) 两部分。表明,肿节风药材种源存在着显著的产地特异性。

图4 药材真伪鉴别

3 讨论

近年中药材种源混乱,药材质量不断下降影响中药药效,关乎临床运用。在本研究基础上,可进一步推进谱效研究[11],以期为肿节风药材运用打开新局面。本研究建立的方法精密度高、重复性好、稳定性强,可用于肿节风药材的质量控制,较好地鉴别肿节风药材的真伪。