蒙古沙冬青化学成分及其细胞毒活性

赵红梅,陈建平,张 屏,张 烨,李 冰,包保全

(内蒙古医科大学,内蒙古 呼和浩特 010110)

沙冬青,又名孟和哈日嘎讷,是中国重要的珍惜濒危物钟[1-2]。在寒冷的冬天,蒙古农牧民的手脚就容易冻伤,把沙冬青的茎叶煮沸,用浸泡液浸泡伤处,有明显疗效。据目前的考证,该属仅有2 种,分别为新疆沙冬青Ammopiptanthus nanus (M.Pop.) Chengf 和蒙古沙冬青Am-mopiptanthus mongolicus (Maxim.) Chengf.[3]。

沙冬青是唯一的荒地常绿灌木,是当前荒地改造的优良植物,也是一种有毒植物,可导致牲畜中毒和死亡,也可用作农业杀虫剂[4]。目前,对沙冬青的化学成分和生物活性筛选进行的研究尚未见报道。为探索沙冬青中具有药效活性的物质基础,本实验对其进行化学成分研究,并进行细胞毒活性筛选测定[5],以期为合理开发利用这一植物资源提供依据。

1 材料

1.1 仪器 制备液相色谱仪(日本Shimadzu Corporation 公司)；分析液相色谱仪(美国Agilent 公司)；98-1-B 电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；DK-98-ⅡA 型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；KQ-500DE 超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；Hei-VAP Precision 旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；SHZ-D 循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；艾科浦超纯水机(重庆颐洋企业发展有限公司)；GoodSee-Ⅱ薄层拍摄仪(上海科哲生化科技有限公司)。

1.2 试剂与药物 虾卵(美国Ruby Artemia 公司)；无碘海盐(美国Sigma-aldrich 公司)。95% 乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、碘化铋钾、硅钨酸、镁粉、氯化铝、氯化铁、浓硫酸、浓盐酸、乙酸酐(辽宁九熙商贸有限公司)。

1.3 样品 蒙古沙冬青于2018 年9 月从内蒙古阿拉善盟采集,由内蒙古医科大学包保全教授鉴定为豆科沙冬青属植物蒙古沙冬青 Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.)Chengf。将样品储存在实验室中,自然干燥并粉碎成粗粉,通过50 目筛后使用。

2 方法

2.1 提取与分离 取1 kg 干燥的蒙古沙冬青粗粉,95%乙醇回流萃取3 次,75%乙醇回流并萃取3 次,每次2 h[6],滤过,合并滤液,回收溶剂至浸膏238.8 g,溶于水,加热,用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取,将其浓缩并干燥,分别得到相 应部分17.1 g、13.3 g、8.28 g、60.4 g。余下水层经C18中低压液相,依次用95% 乙醇、50%乙醇、蒸馏水进行洗脱,浓缩溶剂,得7 个部位的提取物,低温保存备用。

2.2 细胞毒活性测定 采用丰年虾幼虫作为实验对象[7]。称取无碘海盐2 g,加到1 000 mL 蒸馏水中,制成质量分数为2.5%的人工海水(pH 8.0～8.5)。取2 g 丰年虾的虾卵放入人工海水中,并不间断通氧,28 ℃避光孵化24 h,即得幼虫,备用。

2.2.1 分组与给药 将实验分成4 组,将7 个部位的提取物分别用人工海水制备成10、100、1 000 μg/mL 样品溶液,将5 mL 溶液置于10 mL 试管中,并用人工海水作为阴性对照,每个样品测3 次,用移液枪将幼虫转移到试管中,每管20 只,在28 ℃水浴下培养24 h。

2.2.2 测定与结果处理 将试管中的虾倒入培养皿中,通过放大镜计算出每个试管中死亡幼虫的数量(无运动),计算校正死亡率,公式为校正死亡率=[(T-C)/ (1-C) ]×100% (T 为样品致死率,C 为阴性对照致死率)。采用SPSS 软件的Prohibit 模型,计算半数致死浓度(LC50)[8]。

2.3 理化检识

2.3.1 生物碱检识 通过细胞毒实验,获得活性部位是水层、乙酸乙酯层、正丁醇层,甲醇溶解,配制成溶液。碘化铋钾法为取1 mL 样品,加入1～2 滴碘化铋钾,如果有红棕色沉淀,则呈阳性。硅钨酸法为取1 mL 样品,加入1～2 滴硅钨酸,如果有淡黄色或灰白色沉淀,则呈阳性。

2.3.2 黄酮检识

2.3.2.1 盐酸-镁粉反应 取样品溶液,加入1 mL 甲醇,加入少量镁粉,摇匀,加入几滴浓盐酸,1～2 min 内即可显色,若反应显紫红色,则呈阳性。

2.3.2.2 三氯化铝反应 取样品溶液,将样品溶液滴在滤纸上分2 行,然后在下行滴加三氯化铝,上行用作空白对照。置于紫外灯下,如果滴有三氯化铝的一行显淡黄色荧光,则呈阳性。

2.3.2.3 三氯化铁反应 取试管中的样品溶液,加入氯化铁的乙醇溶液,观察现象,如果显紫色,则呈阳性。

2.3.3 三萜皂苷检识

2.3.3.1 Liebermann-Burchard 反应 取粉末样品,加入醋酸酐混合,加入几滴浓硫酸-乙酸酐(1∶20),观察。如果颜色变化从黄色变为红色、紫色、蓝色、污绿色,则呈阳性。

2.3.3.2 Salkowski 反应 取适量样品粉末溶于三氯甲烷中,然后沿管壁慢慢加入浓硫酸,若上层出现红色,下层出现绿色荧光,则呈阳性。

2.3.3.3 泡沫反应 取适量样品,加10 倍量水,煮沸10 min 后过滤,滤液置试管,若经振摇后产生持久性泡沫,则呈阳性。

2.4 薄层层析

2.4.1 对照品溶液制备 称取苦参碱、山柰酚、齐墩果酸、对照品各0.5 mg,用甲醇溶解定容至2 mL,制备成0.25 mg/mL 的溶液作为对照,放于4 ℃冰箱中备用。

2.4.2 供试品溶液制备 各称取1 mg 乙酸乙酯层、正丁醇层、水层样品,分别加入少许甲醇溶解定容至5 mL,即得0.2 mg/mL 供试品溶液,置于4 ℃冰箱中备用。

2.4.3 生物碱薄层层析 用毛细管分别吸取对照品、供试品溶液各1 μL,点于硅胶GF254板上,以氯仿-甲醇-氨水(8∶2∶0.4)[9]为展开剂,碘化铋钾为显色剂。

2.4.4 黄酮薄层层析 用毛细管吸取对照品、供试品溶液各1 μL,点于G 板上,采用乙酸乙酯-甲醇-水(8∶1∶1)[10]为展开系统,1%三氯化铝溶液为显色剂,365 nm 下观察。

2.4.5 三萜皂苷薄层层析[11]用毛细管吸取对照品、供试品溶液各1 μL,点于GF254板上,采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇(9∶7∶1) 为展开系统,展距10 cm,吹干,喷以10%浓硫酸-乙醇溶液,置于105 ℃条件下显色完全。

3 结果

3.1 细胞毒活性 细胞毒活性与癌细胞抑制之间存在相关性[12],由海虾的致死活性来测定。通过海虾的致死法测定半数致死量,若粗提物的LC50＜1 000 μg/mL,单体的LC50＜100 μg/mL,则表明样品具有明显的活性[13]。图1 表明,乙酸乙酯层、正丁醇层和水层均具有一定的细胞毒活性。其中,水层的活性最强,对海虾幼虫致死的LC50值为70.02 μg/mL。三者的细胞毒活性存在显著差异 (P ＜0.05)[14],有强到弱依次为水层、乙酸乙酯层、正丁醇层。

图1 海虾幼虫致死生物活性测定结果

3.2 活性部位检识 通过对蒙古沙冬青7 个提取部位细胞毒活性测定,显示3 个部位有细胞活性,将这3 个有效部位的提取物进行理化检识,见表1。由此可知,水层物质与生物碱检识试剂呈阳性,与黄酮检识试剂和三萜皂苷检识试剂均呈阴性,表明水层中含有生物碱,不含有黄酮和三萜皂苷；乙酸乙酯层物质与生物碱检识试剂和三萜皂苷检识试剂均呈阴性,与黄酮检识试剂呈阳性,表明乙酸乙酯层含有黄酮而无三萜皂苷和生物碱；正丁醇层物质与生物碱检识试剂和黄酮检识试剂呈阳性,与三萜皂苷检识试剂呈阴性,表明正丁醇层含有生物碱和黄酮而无三帖皂苷。

表1 蒙古沙冬青不同有效部位理化检识结果

本实验采用薄层色谱对蒙古沙冬青3 个有效部位的提取物进行分析,结果见图2。图2A 从左到右分别是正丁醇层、乙酸乙酯层、水层,苦参碱作为对照品,从图中斑点的数量和颜色深浅分析,只有正丁醇层和水层显示相同的斑点,而乙酸乙酯层物质没有显示斑点,而且水层中的生物碱种类和含有量超出正丁醇层中的；图2B 从左到右分别是正丁醇层、乙酸乙酯层、水层,山柰酚作为对照品,从图中得知,只有正丁醇层物质和乙酸乙酯物质含有黄酮类,水层在365 nm 的紫外荧光下均未见相同荧光；图2C 从左至右依次为正丁醇层、乙酸乙酯层、水层,齐墩果酸作为对照品,在对照品显色的对应位置上,正丁醇层、乙酸乙酯层、水层都不显示斑点。

图2 各样品薄层色谱图

4 讨论

本实验对蒙古沙冬青7 个部位进行细胞毒活性测定,并检测出有3 个部位有海虾幼虫致死活性,其中水层的海虾幼虫致死率显著高于其他组分,由此可知蒙古沙冬青提取物水层是具有细胞毒活性的主要部位[15],这与理化检识、薄层检识的结果一致。此外,沙冬青对人体是否安全可靠,是否可以抗肿瘤尚不明确,将在今后研究中进一步探索。