基于网络药理学的升血小板胶囊物质基础及其作用机制研究

李霖枫,陈重华,李胜男,李天平

(1.四川大学华西药学院,四川 成都 610041;2.四川大学华西医院,四川 成都 610041)

升血小板胶囊是由国家食品药品监督管理总局(CFDA) 批准的复方中药制剂(国药准字Z20025029),收载于《国家中成药标准汇编内科气血津液分册》[1],由青黛、牡丹皮、连翘、仙鹤草、甘草配伍而成,方中青黛功效清热解毒、凉血消斑,为君药；牡丹皮功效清热凉血、活血化瘀,为臣药,佐以止血健脾的仙鹤草、消肿散结的连翘,使以清热解毒、调和诸药的甘草,诸药合用,共奏清热解毒、凉血止血、散瘀消斑作用。临床研究表明,该制剂对原发性血小板减少性紫癜有十分显著的疗效,常与激素类药物联用,总有效率达90%以上,未见严重不良反应和肝肾毒性,而且长期耐受、价格低廉、口服方便,临床广泛使用[2-4],但其物质基础和作用机制尚不明确,缺少相关药理作用的系统性探索。

中药成分组成复杂,能同时作用于体内多个靶点,通过多途径、多层次、多机制发挥协同疗效[5],但传统药物研究遵循“一药、一靶、一病” 线性模式,难以有效地阐明中药的治病机制。网络药理学将药物研究模式转变为“多成分、多靶点、多疾病”[6],是探索中药药效物质基础、方剂配伍理论、药理作用机制的新方法[7]。因此,本研究通过该方法探寻升血小板胶囊有效成分和作用靶点,通过靶蛋白互作、功能和通路富集(图1) 系统地研究该制剂治疗原发性血小板减少性紫癜的可能机制,为深入开展相关实验及临床研究提供参考。

图1 升血小板胶囊作用机制研究的网络药理学流程图

1 方法

1.1 成分筛选与靶点预测 通过TCMSP[8](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCM Database@ Taiwan[9](http://tcm.cmu.edu.tw/) 等中草药系统药理平台,以“青黛” “牡丹皮” “连翘” “仙鹤草” “甘草” 为关键词检索化学成分,结合相关文献,收集整理各组分所含成分。口服生物利用度(Oral bioavailability,OB) 是指所给药物进入人体循环的药量比例,而类药性(Drug-likeness,DL) 是指化合物与已知药物的相似性,两者共同反映化合物的成药性。按照TCMSP 建议,通过该平台自带的条件筛选功能,以OB≥30%、DL≥0.18 为标准,筛选满足条件的化合物。另外,不满足上述条件但有文献或数据支持、具有明确生物活性的化合物也确定为候选成分,以避免遗漏。再通过PubChem 数据库 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),获取候选成分的相关化学信息和PubChem CID。

Similarity ensemble approach[10](SEA)(http://sea.bkslab.org/) 是以化学结构为核心、比较靶标相似性的一种药物靶点预测方法,将候选成分的Canonical SMILES 导入该平台,预测其潜在靶点,选择“Homo sapiens”、Tc≥0.7[10-11]的靶点作为候选靶点,进行后续分析。再通过Uni-Prot 蛋白数据库(https://www.uniprot.org/),确认候选靶点的相关信息和UniProt ID。

1.2 成分-靶点网络构建 通过Cytoscape3.7.1 软件构建候选成分与其预测靶点之间的互作网络,节点(nodes) 表示中药、化合物或靶点,边(edges) 表示两者之间的相互作用。在网络中,度(degree) 是指一个节点的与其他节点的连接数量,度越大,该节点的直接相关节点越多,在网络中越重要,故本研究根据候选成分该数值的大小来确定关键化合物。

1.3 靶蛋白质互作网络构建 为了解靶蛋白之间的互作关系(protein-protein interaction,PPI),将所有靶蛋白导入String 数据库(https://string-db.org/),物种选择“Homo sapiens”,最低互作分数设为“medium confidence”,获取PPI 数据,再用Cytoscape3.7.1 构建预测靶点互作网络。在网络中,度中心性(degree centrality,DC)、介数中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC) 是判断节点关键程度的重要拓扑参数,本研究通过Network Analyzer 计算网络各个节点DC、BC、CC 以判断节点重要性,再按照DC 进行节点排列作图,圆点越大,颜色越亮,节点DC 越大。

1.4 GO 生物过程、KEGG 信号通路富集分析 通过String数据库进行GO 生物过程、KEGG 信号通路富集分析,以FDR＜0.05 为限定值,对所得GO term、KEGG pathway 进行筛选。

2 结果

2.1 候选成分筛选 通过TCMSP、TCM Database@Taiwan及文献检索,以OB≥30%、DL≥0.18 或具有明确生物活性为筛选条件,共得到163 种候选成分。其中,青黛19 种,主要有 indirubin、indigo、qingdainone、tryptanthrin、quercetin 等(indirubin 为升血小板胶囊指标成分)；牡丹皮19 种,主要有paeoniflorin、benzoyl-paeoniflorin、paeonol、quercetin、kaempferol 等；连 翘40 种,主要有phillyrin、(-) -phillygenin、arctiin 等；仙鹤草23 种,主要有agrimol、agrimonolide、vitamin K1 等；甘草94 种,主要有liquiritigenin、glycyrol、glyasperin 等。升血小板胶囊含有大量生物碱、黄酮、有机酸、萜类、甾体类化合物,其中quercetin、isorhamnetin、β-sitosterol 为 5 种组方 药材共 有成分,kaempferol、oleanic acid、caffeic acid 等13 个化合物在2 种以上中药中同时存在。

2.2 候选成分潜在靶点预测 设定Tc≥0.7 为阈值,71 种候选成分预测出186 个靶点(其余92 种无满足阈值的靶点)。其中,青黛12 种成分匹配到80 个靶点,牡丹皮12种成分匹配到93 个靶点,连翘29 种成分匹配到131 个靶点,仙鹤草16 种成分匹配到136 个靶点,甘草32 种成分匹配到123 个靶点。

2.3 候选成分-靶点网络分析 将5 种组方药材163 种候选成分、186 个潜在靶点导入Cytoscape3.7.1 中,构建成分-靶点网络,结果见图2,根据Network Analyzer 计算结果,网络中含有354 个节点、744 条边,其中549 条边表示化合物与其潜在靶点之间的相互关系；在163 种候选成分中,有8 种度值大于20,分别是quercetin (66)、ellagic acid(43)、kaempferol (37)、myricetin (38)、luteolin (34)、apigenin (35)、isorhamnetin (26)、ferulic acid (23)；在186 个预测靶点中,有7 个度值较高,依次为CA7 (19)、CA4 (14)、CA12 (16)、AKR1B1 (13)、CA2 (11)、ABCG2 (11)、CYP1A2 (10)。由此说明,在升血小板胶囊候选成分-靶点网络中,1 个化合物可作用于多个靶点,而1个靶点也可与多个化合物相互作用。

图2 升血小板胶囊候选成分与潜在靶点网络

2.4 靶蛋白互作网络分析 通过String 平台获得186 个靶蛋白的互作关系,将数据文件导入cytoscape3.7.1,构建PPI (图3),由于有8 个靶蛋白未参与蛋白互作,故网络中实际含178 个节点、1 520 条边,可知具有较多相互关系的靶点 有AKT1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1、ESR1、PTGS2、CCND1、MMP9、CREB1 等。根据计算结果,将DC、BC、CC 排名前20 的靶蛋白建立交集,得到AKT1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1 等13 个三者数值均较高的潜在靶点(表1),在PPI 中均发挥关键作用,其中AKT1度值(87) 远高于其余靶点,是PPI 网络中连接其他节点的桥梁。

图3 升血小板胶囊潜在靶蛋白互作网络（按度中心性由大至小排序）

2.5 GO 生物过程富集分析 以FDR＜0.05 为标准,得到1 920条GO bio-progress term,主要有机体对化学物质的反应,细胞信号转导,蛋白质的磷酸化,对酶活性、机体代谢及细胞凋亡的调控等。再按FDR 负对数值大小排序,排名前20 的GO term 见图4,具体信息见表2。

表1 PPI 网络关键靶点

图4 GO 生物过程富集分析（排名前20）

表2 GO 生物过程富集信息（排名前20）

2.6 KEGG 通路富集分析 将186 个靶点通过String 平台进行KEGG 通路富集分析,获得159 条满足FDR＜0.05 的信号通路,排名前20 的见图5,具体信息见表3。根据KEGG pathway 数据库分类标准,159 条信号通路可分为31类,其中癌症通路24 条,包括前列腺癌、神经胶质瘤、膀胱癌等；信号转导通路20 条,包括PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、Rap1 信号通路等；感染性疾病通路19条,包括乙型肝炎、人乳头病毒感染、麻疹等；内分泌系统通路14 条,包括孕酮介导的卵母细胞成熟、内分泌抵抗等；免疫系统通路13 条,包括B 细胞受体信号通路、T 细胞受体信号通路、Fc 受体介导的吞噬作用等。

原发性血小板减少性紫癜(ITP) 与免疫相关通路关系密切,其中Fc 受体介导的吞噬作用是KEGG 数据库列出的ITP 病因通路。升血小板胶囊可能通过调控免疫相关通路,干预DRD2、IL2、SYK、AKT1、PIK3R1 等靶点而发挥作用,还涉及多条癌症相关通路(如前列腺癌、PI3K-Akt 信号通路),可能具有抗肿瘤潜力。

图5 KEGG 通路富集分析（排名前20）

表3 KEGG 信号通路富集信息（排名前20）

3 讨论

原发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP) 是由人体免疫功能失调所致的一种自身免疫性血液病,以血小板数量减少及寿命缩短、巨核细胞成熟障碍、皮肤黏膜、内脏出血为特征[12-13],其发病机制与抗血小板自身抗体(PAlg) 介导的血小板过度破坏或生成不足有关[14]。升血小板胶囊具有清热解毒、凉血止血、散瘀消斑的作用,临床上多与激素、泼尼松、白介素11 或丙种球蛋白等药物联用,不仅能调节机体免疫功能,还可提高血小板数量,增强血小板聚集能力[15]。曹波[16]以其联合重组人血小板生成素注射液治疗特发性血小板减少性紫癜,发现血小板恢复时间加快,血清PAlgG 水平显著下降,临床总有效率高达91.18%；刘婧依等[17]联合其和花生衣提取液治疗原发性血小板减少性紫癜,发现外周血中CD8+明显降低,CD4+都明显升高,T 细胞亚群恢复正常,血小板数量增加；何牧卿等[18]以其和泼尼松对66 名免疫性血小板减少性紫癜患者进行治疗,发现临床疗效显著高于单用泼尼松,而且外周血CD4+CD25+Treg 细胞和IL10、TGF-β1血清水平均显著升高,表明该制剂可通过调节CD4+CD25+Treg 细胞数量或功能来参与原发性血小板减少性紫癜发病进程。

本研究通过网络药理学考察升血小板胶囊治疗原发性血小板减少性紫癜的物质基础和作用机制,从中获得163种化学成分及186 个潜在作用靶点,其中槲皮素、鞣花酸、山柰酚、木犀草素、异鼠李素、β-谷甾醇等为关键化合物,AKT1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1、PIK3R1 等13 个靶点为核心靶点。KEGG 信号通路富集结果显示,升血小板胶囊参与多条免疫相关通路(如Fc 受体介导的吞噬作用、T 细胞受体信号通路) 和信号转导通路 (如PI3K-Akt、MAPK 信号通路),并与PI3K-Akt 信号通路关联度最高,涉及潜在靶点28 个,其中SRC、PIK3R1、AKT1、CREB1、HSP90AA1、SYK 等均为PPI 网络重要靶点。由此推测,升血小板胶囊治疗原发性血小板减少性紫癜的作用机制可能是(1) 阻止血小板抗体-抗原复合物与巨噬细胞膜表面的Fc 受体识别并结合,避免酪氨酸激酶活化而激活下游信号通路,防止肌动蛋白聚合和吞噬体形成,减弱巨噬细胞对血小板的吞噬作用,最终使血小板数量回升；(2) 通过干预PI3K-Akt-mTOR 通路来调控B 细胞和T 细胞的增殖、凋亡、分化[19-20],减少抗血小板自身抗体的产生 (如PAlgG),促进T 细胞亚群数量与功能的平衡(如Th 细胞、Tc 细胞、Treg 细胞),影响相关细胞因子分泌(如IL-2、IL-10、TGF-β1),与已有文献资料基本吻合,可为后续相关研究提供参考。

由于PI3K-AKT 信号通路与肿瘤细胞的增殖、存活、凋亡及迁移等有关[21],故结合靶点预测和通路富集结果,本研究认为升血小板胶囊还可能通过调控PI3K-Akt 信号通路来发挥抗肿瘤作用,与其临床应用和文献资料基本契合。首先,升血小板胶囊临床上用于治疗原发性血小板减少性紫癜时,可调节免疫细胞数量与功能平衡,干预细胞免疫和体液免疫,故理论上可通过调节机体免疫功能而发挥抗肿瘤作用。其次,该制剂含有大量抗肿瘤活性物质,如青黛以靛玉红、靛蓝、青黛酮、色胺酮为主要成分,具有抗菌、抗炎、抗癌等作用和免疫调节功能,其中靛玉红抗肿瘤活性显著,能抑制多种癌细胞增殖[22-23]；丹皮酚是牡丹皮主要药效成分,可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用[24]；仙鹤草具有黄酮、有机酸、三萜等活性化合物,广泛用于防治肿瘤,在多数处方中超剂量使用[25]；连翘、甘草可调节机体免疫功能[26-27]。但目前尚无关于升血小板胶囊治疗肿瘤的报道,方中5 种中药配伍使用是否具有上述功效仍需要通过进一步实验进行验证。