基于网络药理学对十味香鹿胶囊治疗乳腺癌作用机制的研究

李春楠,吕经纬,高 旭,高晓晨,张凯月,孙佳明,张 辉

(长春中医药大学,吉林省人参科学研究院,吉林 长春 130117)

十味香鹿胶囊是获得国家专利的上市新药(国药准字Z20120003),由人参、鹿角托盘、薤白、天冬、香附、桔梗、蜈蚣、莪术、浙贝母、鳖甲10 味中药组成,具有疏肝解郁、理气化痰、软坚散结、扶正去邪等功效,对肝气郁滞、痰凝气结所致乳腺增生、乳房胀痛有良好疗效[1-2]。同时,方中人参皂苷[3]、鹿角托盘总肽[4]等成分可治疗肿瘤,使得该复方治疗乳腺癌上也有很好的作用。

乳腺癌是女性恶性肿瘤发生第一位的疾病,发病率和死亡率均呈持续上升的趋势[5],如何从根本上治疗仍是难以攻克的问题,其病因不明确,无确切预防措施,而且对于晚期病情缺少有效根除方法。目前,治疗该疾病基本靠手术和化疗,但对患者伤害较大,故研发一种不良反应小、疗效强的中药新药是非常有意义的。

网络药理学是近年来兴起的一种综合系统生物学、药理学等多学科的研究方法,其科学性、可靠性、与中医药理论匹配性均已经被许多学者证实[6],可从多方向、多层次对中药复方进行分析,完全符合其多成分、多靶点、多通路的特点,通过构建“活性成分-疾病靶点-疾病通路” 网络,可清晰明了地分析其针对疾病的作用靶点及通路。因此,本研究采用网络药理学探究十味香鹿胶囊治疗乳腺癌的作用机制,以期为该复方基础研究和临床应用提供科学依据。

1 方法

1.1 化学成分收集和筛选 通过TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) 中药数据库检索十味香鹿胶囊中10 味中药(人参、桔梗、香附、天冬、薤白、蜈蚣、莪术、浙贝母、鹿角托盘、鳖甲) 所有化学成分。在筛选阶段,TCMSP 数据应用口服生物利用度 (OB)、类药性(DL) 筛选,阈值分别为OB≥30%,DL≥0.18；BATMANTCM 的数据由分数(Score) 和P 值(P Value) 筛选,阈值分别为score≥30、P≤0.05。

1.2 化学成分作用靶点预测 筛选出的有效成分在美国国立生物技术信息中心 (NCBI,https://w-ww.ncbi.nlm.nih.gov/) 查询相应SMILES 号,通过SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、SEA (http://sea.bkslab.org/)、Drugbank (https://www.drugbank.ca/) 进行成分-靶点预测,再收集TCMSP 上给出的预测靶点,将4 个数据库中的成分-靶点合并、筛重,确定复方中所有成分预测的靶点。

1.3 疾病相关靶收集点 采用TTD (https://db.idrblab.org/ttd/)、DisGeNET (http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)、Drugbank 等数据库,收集与乳腺癌相关的靶点。

1.4 治疗乳腺癌活性成分与靶点筛选 将前期检索的化学成分预测靶点、疾病靶点导入Uniprot (https://www.uniprot.org/) 中,考察范围定位到人类,最后转化成对应的Uniprot ID、基因名称。以Uniprot 号为桥梁,将复方中所有成分预测靶点与疾病对应靶点进行合并,查找重复项,交集,最终确定治疗乳腺癌的核心靶点和活性成分,并查找相应药材的归属。

1.5 GO 生物功能分析、KEGG 通路富集 通过Cytoscape3.7.1 软件中的ClueGo 插件对核心靶点进行GO 功能富集(P≤0.01),分析药物作用靶点的生物学过程,阐明复方中化合物靶点蛋白在基因功能中的作用。将核心靶点导入Metascape 数据库 (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1),选择KEGG 通路,物种设置为人,进行通路富集分析,阐明核心靶点在信号通路中的作用,得到抗乳腺癌主要作用通路及对应靶点。

1.6 “中药-成分-疾病靶点-通路” 网络图构建 将10 味中药、活性成分、核心靶点、KEGG 通路分别导入Cytoscape3.7.1 软件中,以四者为节点,选用Merge 功能,它们之间有相互关系的分别用边相连,构建“中药-成分-疾病靶点-通路” 网络,点击网络分析对其进行拓扑参数分析。

1.7 分子对接进行靶点验证 通过Systems Dock 在线分子对接网站 (http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index) 将Degree 值较高的关键靶点和活性成分进行分子对接,用于阐明配体如何作用于复杂的分子网络,验证靶点蛋白与化学分子结构的关系。然后,在该网站按照Step1-4里要求,将排名靠前的靶点与活性成分输入网站,进行分子对接,得到docking score 和分子对接可视图。

2 结果

2.1 活性成分收集和筛选 十味香鹿胶囊活性成分共793种,其中人参293 种、桔梗105 种、香附104 种、天冬32种、薤白87 种、蜈蚣8 种、莪术81 种、浙贝母44 种、鹿角托盘16 种、鳖甲23 种。经筛重后,最终得到253 种符合条件者,其中人参119 种、桔梗21 种、香附30 种、天冬8 种、薤白23 种、蜈蚣5 种、莪术6 种、浙贝母6 种、鹿角托盘16 种、鳖甲19 种。

2.2 成分预测靶点 十味香鹿胶囊有效成分对应的靶点共8 156 个,其中人参2 414 个、桔梗449 个、浙贝母401 个、莪术243 个、香附1 368 个、薤白885 个、天冬788 个、蜈蚣114 个、鹿角托盘724 个、鳖甲770 个,经合并筛重后,最终得到1 406 个不重复的。

2.3 疾病靶点筛选 经筛重后,得到十味香鹿胶囊中有100 个疾病靶点。

2.4 疾病核心靶点与活性成分 十味香鹿胶囊与乳腺癌交集的核心靶点共43 个,登陆DisGeNET 网站,输入Uniprot查找其蛋白归属,见表1,复方中治疗乳腺癌的活性成分共110 种,见表2。

2.5 GO 功能富集分析 将43 个核心靶点输入Cytoscape 3.7.1 软件中的ClueGO 插件,得到8 个生物学过程,分别为磷脂酰肌醇介导的信号传导过程(phosphatidylinositolmediated signaling)、细胞衰老过程(cell aging)、调节有丝分裂细胞周期的G1/S 转换过程 (regulation of G1/S transition of mitotic cell cycle)、前列腺增长过程(prostate gland growth)、前列腺 发展过 程 (prostate gland development)、磷脂酰肌醇3-激酶信号的调控(regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)、器官生 长过程(organ growth)、干细胞增殖的正向调控过程(positive regulation of stem cell proliferation),见图1。另外,通过ClueGo功能分析生物学过程互作网络可发现生物过程之间的相互作用关系,图2 显示不同生物过程的相互作用,不同颜色代表不同生物过程,节点的大小代表调控的强弱,节点间的连线代表相互作用,其中positive regulation of stem cell proliferation 生物学过程在治疗乳腺癌中是独立的。

图1 ClueGo 功能分析生物学过程

2.6 KEGG 通路分析 得到EGFR 酪氨酸激酶抑制通路(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、微小RNA 癌症通路(MicroRNAs in cancer)、P53 信号通路(P53 signaling pathway) 等9 大类通路,见图3。另外,还发现癌症通路(Pathways in cancer)、PI3K-Aktsignaling 通路(PI3K-Aktsignaling pathway)、蛋白聚糖癌症通路(Proteoglycans in cancer)、MicroRNAs in cancer、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance 等76 条KEGG 通路及其对应的靶点。

表1 十味香鹿胶囊治疗乳腺癌的核心靶点信息

表2 十味香鹿胶囊治疗乳腺癌的活性成分及药材归属

图2 ClueGo 功能分析生物学过程互作网络

图3 KEGG 通路富集分析

2.7 “中药-成分-疾病靶点-通路” 网络图 网络图见图4,共有239 个节点、842 个边,平均Degree 为7.046 (该值是表示与该节点相连的边的条数,节点度越高,其参与的生物过程越多),大于等于7.046 的有51 个,其介数(Betweenness Centrality)、接近中心性 (Closeness Centrality)、平均最 短路径长度 (AverageShortest PathLength) 表明了其重要性,网络拓扑参数见表3。由此可知,相同成分可对应1 个或多个靶点,而不同成分又可作用于同一靶点,具有协同作用。

在活性成分方面,大于平均Degree 值的活性成分有11种,其中槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素等Degree＞10的排在前4,分别对应28、15、12、12 个度,表明成分对应了多个中药和靶点。靶点是链接成分和通路的关键,大于平均Degree 值的有23 个,大于30 的分别为AKT1、PIK3CA、ESR1、AR、PGR、TP53、EGFR,对应的活性成分和通路较多,可能是十味香鹿胶囊治疗乳腺癌的重要靶点。在通路方面,对应靶点大于平均Degree 值的有12 个,其中Pathways in cancer、Proteoglycans in cance、PI3K-Akt signaling pathway、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、MicroRNAs in cancer 比较重要。

2.8 分子对接 选择槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素活性成分,以及AKT1、PIK3CA、ESR1、AR 关键靶点,输入Systems Dock 在线分子对接网站,由于PIK3CA、AR在数据库无蛋白结构,故只以AKT1、ESR1 为验证靶点,结果见图5,可知槲皮素、山柰酚、木犀草素score 值均高于天然配体的分值,而刺槐素score 值较低。槲皮素、山柰酚、木犀草素活性成分与上述靶点的3D、2D 对接图见图6～7,进一步证明了它们与靶点的结合性较强,可起到较好的治疗作用。

3 讨论

网络药理学是通过检索大数据来对药物进行化合物、靶点、通路、代谢物等多种指标进行分析的新模式,其整体性、系统性、动态性的特点与中医整体观念、辨证论治的理论相一致[7]。十味香鹿胶囊可用于治疗肝气郁滞、痰凝气结所致乳腺增生、乳房胀痛等疾病,近年临床发现该复方还有抗乳腺癌的功效,故本研究采用网络药理学对其活性和机制进行探讨,可为更好地研发相关新药提供思路。

图4 中药-成分-疾病靶点-通路网络图

图5 槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素活性成分与AKT1、ESR1 靶点的分子对接值

十味香鹿胶囊具有多成分、多靶点、复杂性等特点,在检索全方成分数据库时发现,鹿角托盘、蜈蚣、鳖甲等动物药涉及较少,表明网络药理学对该类成分的研究具有一定局限性。网络图分析显示,方中Degree 排名前5 的活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、刺槐素、β-谷甾醇可直接作用到AKT1、AR、ESR1、PIK3CG、TP53、VEGFA等关键靶点,其中槲皮素是桔梗、香附、薤白、天冬有效成分,具有较好的抑制细胞增殖作用,王根进等[8]发现它能通过抑制EGFR/AKT、mTOR 信号通路来促进人乳腺癌细胞株T47D 的细胞凋亡过程,促进T47D 细胞的Bax、caspase3、caspase9 凋亡蛋白及mRNA 水平增加；木犀草素是桔梗、香附有效成分,Lee、彭钰芳等[9-10]报道它在一定浓度下(＜100 μmol/L) 能显著抑制乳腺癌细胞MDAMB-231 增殖,并可降低细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子P21 表达,从而使细胞周期停滞在G2/M 期和S 期；刺槐素是桔梗中的成分,能对应多个靶点,具有雌激素样作用,在0.001～10 μmol/L 范围内可通过调节ERα 受体表达来促进T47D 细胞的增殖[11]；山柰酚是人参、香附中的成分,具有抗癌、消炎作用,能抑制人乳腺癌细胞、肝癌细胞、大鼠嗜碱性白血病细胞等多种癌症,可直接作用到P53、Bax 等凋亡蛋白[12-14]；β-谷甾醇是人参、天冬、香附、薤白、贝母共有成分,可作用 到AR、BCL2、CYP19A1、ESR1 等核心靶点,对T47D 乳腺癌细胞有抑制作用[15]。此外,十味香鹿胶囊中有51 种活性成分作用AR 靶点,52 种作用ESR1 靶点,41 种作用PGR 靶点,证明全方活性成分具有协同作用。

表3 网络拓扑参数（Degree＞7.046）

图7 槲皮素、山柰酚、木犀草素活性成分与AKT1、ESR1 靶点的分子对接2D 图

同时,拓扑参数中 AKT1、PIK3CA、ESR1、AR、PGR、TP53、EGFR 靶点的Degree＞30,表明它们是核心靶点中较为关键重要的,在乳腺癌治疗过程中参与较多,生物学重要性较大。其中,蛋白激酶B (AKT1) 和磷脂酰肌醇3 激酶(PIK3) 是PI3K-Akt 信号通路中的关键靶点,通过激活下游分子在细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥作用,是治疗癌症中常见的靶蛋白；ESR1 是雌激素受体α,具有调节雌激素作用,雌激素通过与其结合来发挥抗癌作用[16]；AR 是雄性激素受体,在乳腺癌发生过程中起着重要作用,与HER-2 信号通路可交叉调节,AG825 抑制剂和抗雄激素药物可负调节两者表达,从而抑制细胞增殖和肿瘤生长[17-18]；PGR 是孕激素受体,其表达缺失是激素敏感性乳腺癌预后不良的原因,同时它也是ER 信号转导通路的下游基因产物对治疗乳腺癌起着重要作用[19]；P53 凋亡蛋白在PI3K-Aktsignaling pathway、Pathways in cancer 里都起着重要作用[20],其诱导的miRNA 也可抑制细胞周期调控因子或抗凋亡相关蛋白表达,进而调控细胞周期和细胞存活[21]；表皮生长因子受体(EGFR) 是肿瘤学研究中常用的分子标记物,在多种恶性肿瘤的癌变、进展过程中有重要作用,有研究者认为其表达升高与肿瘤内血管生成、细胞凋亡障碍有关,可作为恶性肿瘤预后不佳的预测因子及靶向治疗的靶点,同时其信号通路也是细胞凋亡的重要通路[22],与乳腺癌的多个病理生物学指标[如淋巴结转移情况、TNM 分期、雌激素受体 (ESR1)、孕激素受体(PGR) 等]存在相关性,在病情进展中起着重要作用,也可作为参考指标对疾病的转归和预后；ESR1 可特异性结合雌激素,激活SRC-Ras-PI3K-Akt、MAPK/ERK 等下游通路,参与乳腺癌的发生发展,而AR 与其信号通路共同作用于同一个细胞的,前者通过干扰后者与靶基因的结合,阻断后者对靶基因的激活,抑制下游的细胞增殖信号通路,从而起到抑制乳腺上皮细胞增殖的作用,并且还可通过生长因子丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信号通路参与乳腺的发育,进而调节乳腺癌细胞增殖[23]；Luo 等[24-25]发现,治疗乳腺癌的药物可激活肿瘤相关成纤维细胞中的雌激素G 蛋白偶联受体(GPER),可通过EGFR 通路促进细胞生长和迁移,还能促进芳香化酶基因(CYP19A1) 表达和E2合成,这些效应可能会影响肿瘤细胞生物学行为[26]。

另外,MicroRNAs 是一类参与调节细胞的分化增殖凋亡等多种生物学进程[27-28],涉及多个基因及信号传递网络,对乳腺癌有影响,它可调控ESR1 表达,特别是直接靶向调控,可促进乳腺癌发生。例如,MiR-206 参与EGFR介导的乳腺癌向ERα 阴性、Basal-like 型转变过程[29],EGFR 信号可增加miR-206 水平,起到抑制SRC-1、AIB1、GATA-3 的作用,进而抑制ERα 信号通路,促进细胞凋亡,降低多个雌激素反应性基因的表达[30]。

综上所述,十味香鹿胶囊中有多种活性成分作用于同一靶点,也有同一活性成分作用于多个靶点；有多个靶点对应同一通路,也有同一靶点对应多条通路,表明该复方是通过多成分、多靶点、多通路的协同作用来治疗乳腺癌的。虽然方中鹿角托盘、蜈蚣等动物药数据库数据检索受限,但通过靶点、通路预测及临床报道,仍可其所含活性成分可直接作用于AKT、EGFR、P53 等重要靶点,从而起到相关疗效。因此,对十味香鹿胶囊所预测的活性成分及核心靶点可作为今后研究重点,为该复方药效及临床研究提供理论和实验依据。