白术水溶性部位及其洗脱组分促胃肠动力作用的比较

李庆耀,晏 雯,褚洪标,周细根,罗 婷,颜峰光,梁生林

(井冈山大学医学部,江西 吉安 343009)

白术为菊科苍术属植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎,其性温,味甘、苦,归脾、胃经,具有健脾益气功效,中医临床常用其治疗脾胃气虚、运化乏力[1]。马晓松等[2]研究显示,白术煎剂可显著促进动物离体回肠收缩、在体胃排空、肠推进运动；朱金照等[3]对15种理气中药进行筛选,发现白术促胃肠动力作用非常突出,可与临床常用的西药媲美,但其促胃肠动力的活性部位和物质基础不清楚。

丁曙晴等[4]研究表明,白术水煎剂可明显增强体外结肠收缩,而其石油醚、乙醇提取物却未见收缩活性,推测其水溶性部分可能具有促进肠道动力作用；课题组前期离体实验也初步证实,在白术水提液萃取后的乙酸乙酯、正丁醇、水层中,只有水层具有明显的促进肠收缩作用。因此,本实验将考察白术水溶性部位及其洗脱组分对离体肠平滑肌收缩及整体胃排空、肠推进的影响,以期进一步追踪和评价该药材促胃肠动力的活性物质。

1 材料

1.1 动物 清洁级昆明种小鼠,雄性,体质量(20±2) g,由湖南斯莱克实验动物有限公司提供,实验动物生产许可证号SCXX (湘) 2013-0004,饲养于(23±1)℃恒温、每12 h规律/暗交替的环境中,自由饮水和进食,实验前至少需要5 d 的适应环境时间。中国白兔,雌雄不拘,体质量(2.0±0.5) kg,由南昌大学实验动物部提供,实验动物生产许可证号SCXK (赣) 2014-0005。

1.2 试剂与药物 D101 大孔吸附树脂,购自河北沧州宝恩材料有限公司。莫沙比利片,购自成都康弘药业集团有限公司,批号10 030197；其他试剂均为分析纯。炒白术购自吉安市百姓大药房,经专家鉴定为菊科苍术属白术Rhizoma Atractylodis macrocephalae,再制备其水溶性部位及洗脱组分。参考Kitajima 等[5]报道的方法,取已干燥至恒重的白术500 g,粉碎后加入8 倍量蒸馏水煎煮3 次,每次1.0 h,滤过,合并3 次滤液,加热浓缩至1 000 mL,乙酸乙酯萃取3 次,萃取液用旋转蒸发仪减压蒸干回收溶剂,溶于600 mL 水中,即得水溶性部位,取经预处理的D101大孔树脂500 g,装入层析柱中至柱高为85 cm,取300 mL水层,蒸馏水稀释至500 mL 后以1 mL/min 体积流量经大孔树脂柱吸附,依次用水及20%、40%、60%、80%乙醇洗脱,洗脱体积为1 000 mL,洗脱液用旋转蒸仪减压蒸干回收溶剂,30 mL 蒸馏水溶解,即得未吸附物、水洗脱物及20%、40%、60%、80%乙醇洗脱组分。

1.3 仪器 R-200 型旋转蒸发器,购自瑞士步琪公司；RM6240 型微机生物信号采集处理系统,购自成都仪器厂；FA1 604 N 电子天平,购自上海精密科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 离体家兔回肠自发收缩张力测定 参照马晓松等[2]报道的方法,并略加改动。取禁食12 h 的家兔,击昏后立即打开腹腔,找到回盲部,距其15 cm 处剪取一段回肠,置于盛有台氏液并通氧的培养皿中,注射器冲洗肠管后剪去肠系膜。取一段长约1.5 cm 的回肠,肠管两端对角穿线结扎后一端固定在麦氏浴槽底部的钩子上,另一端系在张力换能器上,后者与RM6240 微机生物信号采集处理系统相连,麦氏浴槽盛有20 mL Tyrode’ s 液,温度37 ℃。并持续通氧,肠管初始张力负荷为1.0 g,稳定1 h 后开始记录给药前后回肠收缩曲线。每个组分按累积浓度加入,每次实验结束后用台氏液冲洗3 次,间隔30 min,按未吸附物、水洗脱物及20%、40%、60%、80% 乙醇洗脱组分的顺序依次给药,它们对回肠收缩的影响以收缩率表示,公式为收缩率=(给药后最大收缩张力/给药前最大收缩张力) ×100%。

2.2 小鼠胃排空率、小肠推进率测定 参照王贺玲等[6]报道的方法。将小鼠随机分为对照组(蒸馏水),水溶性部位高、低剂量组,洗脱组分高、低剂量组,阳性组(莫沙必利),每组12 只,灌胃给药,剂量为0.1 mL/10 g,连续5 d。第4 天开始,小鼠禁食不禁水24 h,于第5 天禁水2 h后灌胃给予0.5 mL 营养半固体糊(2.5 g 羧甲基纤维素加到60 mL 水中充分溶解,再加入奶粉4 g、糖2 g、淀粉2 g、碳素墨水1 mL,每加1 次搅拌均匀,配成75 mL 糊状物),15 min 后脱颈处死,剖开腹腔,结扎胃贲门、幽门后,迅速从贲门处至回肠末端分离胃肠,置于白色实验台上,小肠自然拉直铺平。首先,测量幽门至半固体糊前沿、幽门至盲肠部全长的距离,小肠推进率=(幽门至半固体糊前沿的距离/幽门至盲肠部全长的距离) ×100%,再剪下胃,称定全质量,沿胃大弯剪开胃体,洗去胃内容物后拭干,称定净质量,半固体糊胃内残余量=胃全质量-胃净质量,胃排空率=(1-半固体糊胃内残留量/半固体糊质量) ×100%。

2.3 统计学分析 通过SPSS 13.0 软件进行处理,数据以() 表示,组间比较采用t 检验,组内比较采用完全随机设计成组资料的方差分析。 P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 白术水溶性部位及其洗脱组分对离体家兔回肠自发收缩的影响 随着质量浓度增加(5.0、12.5、25.0、50.0 mg/mL),水溶性部位对回肠自发收缩的兴奋效应逐渐增强,收缩率分别为114.0%、131.4%、156.1%、164.0%,与给药前比较均有显著差异(P＜0.01),并呈现出良好的量 效关系,其 中 25.0 mg/mL 与 12.5 mg/mL 比 较,50.0 mg/mL与25.0 mg/mL 比较,差异均有统计学意义(P＜0.01),见图1。另外,水溶性部位40%乙醇洗脱组分对离体肠收缩的促进作用最强,60% 乙醇洗脱组分次之,最大收缩张力均大于给药前(P＜0.01),见表1。因此,选择40%乙醇洗脱组分进行后续研究。

图1 离体家兔回肠自发收缩的量效曲线

表1 白术水溶性部位的洗脱组分对离体家兔回肠收缩的影响（，n=6）

表1 白术水溶性部位的洗脱组分对离体家兔回肠收缩的影响（，n=6）

注:与给药前最大收缩张力比较,**P＜0.01。

3.2 白术水溶性部位及其40%乙醇洗脱组分对小鼠胃排空、肠推进的影响 与对照组比较,水溶性部位高、低剂量组及40% 乙醇洗脱组分高剂量组小鼠小肠推进率升高(P＜0.05,P＜0.01)；胃排空率有所增加,但差异均无统计学意义(P＞0.05),见图2。

4 讨论

图2 白术水溶性部位及其40%乙醇洗脱组分对小鼠胃排空、肠推进的影响（，n=6）

功能性胃肠病在临床上非常常见,主要包括功能性消化不良、肠易激综合征,动力障碍、内脏高敏性是其病理生理特征,表现为胃排空延迟和肠传输减慢[7],并且腹部手术后肠梗阻表现为胃肠内容物传输减慢、食物不耐受、胀气[8]。胃肠动力障碍临床上常用促胃肠动力药治疗,但存在疗效不佳、不良反应严重的问题[9],故研发相关新型药物具有重要意义。中医擅长调理脾胃功能,而白术又是健脾补气要药,故很多临床研究报道其大剂量用于治疗慢性传输障碍性便秘[10-11],以其为组方药材的枳术丸导滞消痞,用于治疗功能性消化不良[12],均安全有效。鉴于此,有必要确定白术促胃肠动力作用的活性部位和物质基础,而不仅仅是停留在粗提物层次上。

目前活性追踪是中药药效物质基础研究的有效方法[13],本实验先用乙酸乙酯萃取白术水提液取后得到水溶性部位,再用D101 大孔树脂对其进一步分离,得到相应洗脱组分。通过离体实验发现,白术水溶性部位促进离体回肠收缩时呈现良好的量效关系,最大收缩率达到164%,而且40%乙醇洗脱物促进作用最强,其收缩率达128.2%,大剂量下小肠推进率均高于莫沙必利；但其促正常胃排空作用均不显著,与朱金照等[3]报道的结果不同,可能是因为本实验采用的是半固体营养糊法测定胃残留率,而文献采用的是葡聚糖蓝-2000 溶液。郑天珍等[14]发现,白术对大鼠离体胃底肌条有较强的兴奋作用,而胃头区的收缩活动是液体食物排空的主要动力,故白术可能主要促进液体的胃排空。综合前期临床报道和实验结果,提示白术提取物主要兴奋肠平滑肌,包括小肠、结肠,与临床上该药材多用于肠道传输性功能障碍相吻合,而治疗功能性消化不良时,由于该疾病主要影响上胃肠道,尤其是胃的排空和容受受损,故需配伍枳实。

白术水溶性成分包括苷类、氨基酸、多糖等成分[1],Kitajima 等[15]采用Amberlite XAD-Ⅱ大孔树脂柱分离得到其甲醇洗脱组分,从中鉴定出9 个糖苷,包括倍半萜糖苷(主要为苍术苷A)、芳香族化合物糖苷(主要为淫羊藿次苷F2)、香豆素糖苷 [主要为莨菪亭-β-D-吡喃木糖基-(1→6) -β-D-葡萄糖苷]等。白术多糖无亲脂基团,不被非极性大孔树脂吸附,本实验也发现其未吸附物和水洗脱物含有大量甜味成分,这些成分在离体实验中无促肠收缩作用,可能不是活性物质。今后,将研究白术水溶性部位40%乙醇洗脱物主要成分,并在整体动物评价其促胃肠动力作用。

综上所述,本实验证明白术水溶性部位及其洗脱组分具有良好的促肠动力作用,糖苷可能是其活性成分,对其进一步研究时有望开发出治疗肠运动或传输障碍性疾病的新药。