敦煌平胃丸对人胃癌细胞株SCG-7901 裸鼠移植瘤的抑制作用

李亚玲 董娟娟李俊杰刘永琦 展文华舍雅莉*

(1.甘肃中医药大学,甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室,甘肃 兰州 730000;2.敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室,甘肃 兰州 730000)

胃癌是发病率、死亡率分别位居第5、3 位的恶性肿瘤,目前临床治疗以手术结合化疗为主,但效果有限,晚期患者采用一线化疗方案的无进展生存率不到1 年,平均总生存时间不到2 年[1-2]。大量研究显示,中医药在抗肿瘤联合治疗中起到了减毒增效的良好疗效[3-4]。敦煌医学具有重要的史料和临床价值,敦煌平胃丸出自敦煌古书《不知名氏辨脉法》,甘肃省名中医王道坤教授将此方进行加减研发的萎胃灵胶囊在治疗慢性萎缩性胃炎、防癌变方面取得显著临床效果[5-6],故本实验观察该制剂对人胃癌SCG-7901 裸鼠移植瘤的抑制作用,并初步探讨其机制。

1 材料

1.1 细胞和动物 人胃癌细胞株SCG-7901 (北京北纳创联生物技术研究院)。BALB/c 裸鼠60 只,SPF 级,雌雄各半,周龄4 周左右,平均体质量18～20 g,购于甘肃中医药大学动物实验中心,动物生产许可证号SCXK (甘) 2015-0002)。本研究经甘肃中医药大学动物伦理委员会审查批准(编号2019-200)。

1.2 药物 敦煌平胃丸免煎颗粒(甘肃省中医药大学附属医院,批号8112053) 由大黄15 g、苦参15 g、干姜15 g、藁本15 g、附子12 g、防风15 g、桔梗15 g、土鳖虫15 g、人参15 g、玄参15 g、当归15 g 组成。顺铂(合肥巴斯夫生物科技有限公司,批号BSF190225,50 mg/支),以0.9%生理盐水配制备用。

1.3 试剂与仪器 RPMI-1640 培养液(美国Gibco 公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；TUNEL凋亡检测试剂盒(美国BD 公司)；细胞悬液制备试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司,批号2019425)；caspase 9、Bcl-2、caspase 3 抗体 (美国GeneTex 公司)。IX-81 型荧光倒置相差显微镜(日本Olympus 公司)。

2 方法

2.1 细胞培养及模型建立 SCG-7901 在含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基中常规培养,将处于对数生长期的该细胞重悬,并调整浓度为1×107/mL,于52 只裸鼠腋下接种0.2 mL 悬浮液,剩余8 只在相同条件下饲养,但不进行任何干预。1 周后,选取瘤体直径大于5 mm、形态较均一的32 只裸鼠作为荷瘤成功,进行下一步实验。

2.2 敦煌平胃丸的制备 将敦煌平胃丸免煎颗粒溶于75 mL煮沸的蒸馏水中,相当于生药量0.7 g/mL,-20 ℃下贮存。

2.3 分组与给药 以未荷瘤的8 只裸鼠为对照组(管饲法喂以10 mL/kg 0.9%NaCl 溶液)。根据给药方式,将32只荷瘤裸鼠随机分为模型组(管饲法喂以10 mL/kg 0.9%NaCl 溶液)、平胃丸组(管饲法喂以140 mg/kg 平胃丸)、顺铂组(腹腔注射20 mg/kg 顺铂)、平胃丸+顺铂组(管饲法喂以140 mg/kg 平胃丸+腹腔注射20 mg/kg 顺铂),于荷瘤成功后24 h 内给药,每天1 次,连续10 d。

2.4 脏器指数、抑瘤率计算 裸鼠给药后,每隔1 d 测量肿瘤短径、长径各1 次,根据Steel 公式[(长径×短径2)/2]计算其体积。停止给药后24 h,脱颈处死裸鼠并解剖,观察肿瘤生长状况、周围脏器受累情况,小心并快速剥离肿瘤组织及主要脏器,滤纸吸干组织液后称定质量,置于-80 ℃冰箱中保存,或用4%多聚甲醛溶液固定48 h。抑制率=(1-V实验组/V对照组) ×100%,脏器指数=脏器平均质量/裸鼠平均体质量。

2.5 病理组织学观察及免疫组化分析 将所需组织用4%多聚甲醛固定48 h 后,常规石蜡包埋切片,HE 染色,光学显微镜下观察其病理情况。将低聚甲醛固定的肿瘤组织切片(厚4 μm) 固定在载玻片上,进行免疫组化染色,按照试剂盒说明书操作加入按比例稀释的一抗caspase 9(1∶200)、Bcl-2 (1∶100)、Bax (1∶200),以PBS 代替一抗作为阴性对照,二抗用辣根过氧化物酶标记,DAB 显色。通过Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件对结果进行判定,每张切片在400 倍下随机选取5 个视野,对视野内棕黄色阳性信号进行图像分析,测定平均积分吸光度值(OD)。

2.6 肿瘤组织中细胞凋亡情况检测 采用TUNEL 法。将上述石蜡包埋的肿瘤组织以4 μm 厚度切片,按照TUNEL检测试剂盒说明书操作检测组织中细胞凋亡情况。每张切片在高倍镜(×400) 下随机选取5 个视野,计数细胞总数及凋亡细胞数量,计算凋亡率,公式为凋亡率=(凋亡细胞数/肿瘤细胞总数) ×100%。

2.7 统计学分析 通过SPSS 21.0、Graph Pad Prism 8.0软件进行处理,计量资料以() 表示,多组间比较用单因素方差分析。 P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 裸鼠一般情况、体质量 荷瘤成功后,各组裸鼠饮食、行为、精神状态等均正常,用药初期亦然。与对照组比较,模型组裸鼠一般情况基本正常；给药后期,顺铂组裸鼠饮食和行动减少,精神状态和毛发光泽较差,出现抱团现象,体质量降低(P＜0.01)；平胃丸组裸鼠一般情况基本正常；平胃丸+顺铂组裸鼠饮食、行动略有减少,体质量下降,但与顺铂组比较有所改善(P＜0.01)。各组裸鼠体质量见图1。

3.2 裸鼠移植瘤体积 与对照组比较,平胃丸组、顺铂组、平胃丸+顺铂组裸鼠移植瘤体积减小(P＜0.01),抑瘤率分别为45.1%、67.2%、70.0%。见图2。

3.3 裸鼠移植瘤病理形态学 模型组裸鼠瘤细胞排列密集紊乱,多见病理性核分裂现象,瘤体较大,坏死较多；敦煌平胃丸组裸鼠瘤细胞排列紊乱,病理性核分裂象略少,可见多个核固缩,坏死较少；顺铂组裸鼠瘤细胞排列紊乱,见多个核固缩,偶有病理性核分裂象,瘤体较小,坏死少；平胃丸+顺铂组裸鼠瘤细胞排列紊乱,见多个核固缩和核碎裂,偶有病理性核分裂象,瘤体小,基本无坏死。见图3。

3.4 裸鼠移植瘤凋亡 与模型组比较,各给药组凋亡率均升高(P＜0.01),以平胃丸+顺铂组更明显(P＜0.01)。见图4、表1。

3.5 裸鼠移植瘤凋亡相关蛋白 与模型组比较,各给药组caspase 9、caspase3 表达升高(P＜0.01)；与顺铂组比较,平胃丸+顺铂组caspase 9、caspase3 表达升高(P＜0.05)；与模型组比较,顺铂组、平胃丸+顺铂组Bcl-2 表达降低(P＜0.01),而平胃丸组无明显变化(P＞0.05)。见图5、表2。

图2 各组裸鼠移植瘤体积

图3 各组裸鼠移植瘤形态学（×400）

图4 各组裸鼠移植瘤细胞凋亡（×400）

表1 平胃丸联合顺铂对裸鼠移植瘤凋亡率的影响（，n=8）

表1 平胃丸联合顺铂对裸鼠移植瘤凋亡率的影响（，n=8）

注:与模型组比较,**P＜0.01；与顺铂组比较,△△P＜0.01。

3.6 裸鼠脾脏形态学 荷瘤不会引起裸鼠脾指数及形态学的改变。与模型组比较,顺铂组裸鼠脾指数升高 (P ＜0.01),并破坏脾脏形态结构,HE 染色镜下可见红髓、白髓结构不清,淋巴小结结构破坏,出现多个巨核细胞；与顺铂组比较,平胃丸+顺铂组裸鼠脾肿大改善(P＜0.05),部分恢复了脾脏形态结构,可见红髓、白髓结构,淋巴小结数量增多,而平胃丸组不影响脾脏大小和形态结构。见图6、表3。

4 讨论

胃癌属于中医“噎膈” “症瘕” “积聚” “伏梁” “心腹痞” “胃脘痛” 范畴,其发生是一个邪气渐深、正气渐伤的过程,从正常的胃上皮,经历炎症、萎缩、肠化生、异型增生,进而发展为胃癌,从起初伤经伤气,到后期伤络伤血,最终导致脾虚阳陷、凝痰聚瘀、胃失和降。敦煌平胃丸中君药大黄破症瘕积聚,留饮宿食,荡涤肠胃；臣药附子、干姜温阳散寒；苦参清热燥湿；藁本、防风、桔梗合用既可升发脾之清阳之气,又可宣利肺气,布散津液,杜绝水湿形成；土鳖虫活血破瘀,通络止痛；人参益气健脾；玄参养阴；当归养血,全方配伍严谨,寒热并用,虚实兼顾,气血同调,可治脾胃阳虚、脾不运化引起的寒热错杂、气滞血瘀和升降失调,临床上治疗慢性萎缩性胃炎及胃脘痛疗效显著[5,7],但鲜有该制剂治疗胃癌的报道。本实验发现,敦煌平胃丸单用对胃癌移植瘤的抑制作用明显,抑瘤率达45.1%,有望进一步从中开发相关小分子药物。

表2 平胃丸联合顺铂对裸鼠移植瘤凋亡相关蛋白的影响（，n=8）

表2 平胃丸联合顺铂对裸鼠移植瘤凋亡相关蛋白的影响（，n=8）

注:与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与顺铂组比较,ΔP＜0.05,ΔΔ P＜0.01。

图5 各组裸鼠移植瘤凋亡相关蛋白（×400）

图6 各组裸鼠脾脏形态学（×400）

表3 平胃丸联合顺铂对裸鼠脾指数的影响（，n=8）

表3 平胃丸联合顺铂对裸鼠脾指数的影响（，n=8）

注:与对照组比较,**P＜0.01；与模型组比较,ΔΔ P＜0.01；与顺铂组比较,#P＜0.05。

肿瘤细胞中凋亡减弱、诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的主要方式之一,本实验发现敦煌平胃丸干预后胃癌移植瘤凋亡率显著增加,与顺铂联用后凋亡率显著升高,表明该制剂抗胃癌机制之一是促进胃癌细胞凋亡；促凋亡蛋白caspase 9、caspase 3 表达显著上调,抗凋亡蛋白Bcl-2 表达显著下调；联用顺铂后,促凋亡蛋白caspase 9、caspase 3表达显著升高。凋亡涉及死亡受体介导(外源) 途径和线粒体(固有) 途径,各种内部刺激(如DNA 损伤、缺氧、氧化应激等) 可激活后者,导致线粒体外膜完整性丧失和细胞色素C 释放,与Apaf-1、caspase-9 一起形成凋亡小体复合物,最终导致效应胱天蛋白caspase 3 被激活,诱发细胞凋亡,并受Bcl-2 家族蛋白的调控[8],可知caspase-9 是固有凋亡途径中的启动子caspase,推测敦煌平胃丸可能通过复杂的机制激活胃癌细胞内caspase-9 依赖的固有凋亡途径,最终激活其促进细胞凋亡。大量研究报道,caspase-9介导的天然化合物引起细胞凋亡,包括异硫氰酸酯、大黄素、丹参酮ⅡA、熊果酸等[9-10],而敦煌平胃丸中君药大黄的主要药效成分大黄素可通过多种机制促进肿瘤细胞凋亡,包括靶向caspase 9[11-12],故可从化合物角度进一步探讨该制剂促进肿瘤凋亡的机制。

化疗药物会引起很多不良反应,如胃肠毒性、骨髓抑制、脾损伤等,从而影响疗效,甚至危及患者生命。近年来研究显示,中草药联合放化疗在肿瘤治疗中发挥了很好的减毒增效作用[13]；本实验发现,敦煌平胃丸联合顺铂可减轻后者单用造成的脾毒性,表现在减轻化疗造成的脾肿大,恢复脾形态结构,增加淋巴小结数量以增强机体免疫力。脾脏是重要的免疫器官和髓外造血器官,化疗期间患者会出现免疫力低下、血细胞减少等临床表现,而敦煌平胃丸可以缓解顺铂对胃癌荷瘤裸鼠造成的脾损伤,与该制剂用药组方的治法治则符合。

综上所述,敦煌平胃丸可通过激活固有凋亡途径来抑制胃癌移植瘤的生长,与顺铂联用后可增加凋亡,并减缓顺铂造成的脾损伤,但其发挥疗效的物质基础和具体分子机制还有待进一步探讨。今后,可通过网络药理学、分子对接等技术来寻找可能的小分子物质并进行配伍,并采用分子生物学实验探讨其疗效及机制,以期为寻找疗效显著、毒性较低的治疗胃癌小分子药物提供方向。