党参药材-饮片-米炒党参的质量等同性探究

白云娥张沙沙 张芮铭高建平侯 静李建宽雷振宏王玉龙肖淑贤

(1.山西医科大学药学院中药学教研室,山西 太原 030001;2.山西振东道地药材开发有限公司,山西 长治 047100;3.山西省心血管病医院药学部,山西 太原 030024)

党参为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.、素花党 参 Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta (Nannf.) L.T.Shen 或川党参Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根[1],是常用药材,始载于清代《本草从新》,有补中益气、健脾益肺的功能,临床上常用于脾肺虚弱、气短心悸、食少便溏、虚喘咳嗽、内热消渴等症,主要分布于山西、甘肃、陕西、四川、湖北等省。党参化学成分较为复杂,主要有多糖、苷类、甾醇类、生物碱、挥发油、三萜类成分等,党参炔苷是《中国药典》 中党参的鉴别指标,浸出物是党参质量的评价指标[2-3]。现代药理学研究表明党参多糖是党参药材中主要的化学成分[4],同时也是发挥党参药效作用的重要成分之一[5-7]。

在2020 年版《中国药典》 一部党参的规定中,党参饮片除米炒党参水分低于“药材” 外,其他项均以“同药材” 规定。中药饮片源于药材而不同于药材,为了客观的评价中药饮片“同药材” 的规定,本实验以不同产地党参药材、饮片及米炒党参为样品,从浸出物、多糖、HPLC 指纹图谱的特征峰及其相对峰面积3 方面,利用现代分析技术及统计学方法对党参药材-饮片-米炒党参的质量进行了等同性研究[8-9],以期为合理评价党参药材-饮片-米炒党参的质量和党参的加工炮制工艺研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 752-紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；KDM 型控温电热套(山东邺城花鲁仪器公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-S 恒温水浴锅(苏州威尔实验用品有限公司)；DGF30-IA 电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂)；BS-124S 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津公司)；RE-52AA 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试剂与药物 无水葡萄糖对照品(纯度≥99%,批号BWB50153,北京北方伟业计量技术研究院,北京世纪奥科生物技术有限公司联合监制)；党参炔苷对照品(纯度≥98%,批号MUST-1301-2901,成都曼斯特生物有限公司)。甲醇(色谱纯,天津市四友精细化学品有限公司)；乙腈(色谱纯,天津市科密欧化学试剂开发中心)；甲醇(分析纯,天津市科密欧化学试剂开发中心)；95%乙醇(分析纯,河南省新乡市三伟消毒制剂有限公司)；苯酚(分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司)；浓硫酸(分析纯,北京化工厂)；水为三蒸水。

1.3 药材 2017 年6 月、8 月分别于党参主产区山西省长治市平顺县、壶关县及晋城市陵川县收集32 批党参药材、36 批党参饮片及8 批米炒党参,经山西医科大学白云娥副教授鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula (Franch) Nannf.的干燥根,标本(201610-01) 及样品存于山西医科大学生药学研究室标本库,具体信息见表1。

2 方法

2.1 浸出物测定 按2020 年版《中国药典》[1](通则2201) 醇溶性浸出物测定法项下热浸法测定,结果见表1。

2.2 多糖测定 在课题组前期研究基础上,采用苯酚-硫酸法[10]测定。精密移取供试品溶液0.1 mL,加入蒸馏水至2.0 mL,再加入1.0 mL 5% 苯酚,摇匀,迅速精密加入5 mL 浓硫酸,摇匀,置沸水浴中加热15 min,冷却至室温,在490 nm 波长处测吸光度,计算多糖含有量,结果见表1。

表1 党参信息及测定结果（n=3）Tab.1 Codonopsis Radix information and determination results （n=3）

续表1

2.3 HPLC 指纹图谱建立 在课题组前期研究基础上[11],按2020 年版《中国药典》 通则0512 建立样品HPLC 指纹图谱,并以党参炔苷为参照峰,对76 批样品的7 种特征成分(特征峰) 相对峰面积进行了测定。

2.3.1 色谱条件 InertSustainl C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈 (A) -0.1%磷酸 (B)；体积流量0.80 mL/min；柱温25.0 ℃；检测波 长220 nm；梯度洗 脱 (0～10 min,5%～10% A；10～30 min,10%～15% A；30～50 min,15%～20%A；50～65 min,20%～30%A；65～75 min,30%～50%A；75～80 min,50%～70%A；80～85 min,70%A)；进样量20 μL。

2.3.2 对照品溶液制备 取党参炔苷对照品约2 mg,精密称定,置于10 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得。

2.3.3 供试品溶液制备 取药材粉末约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加25 mL 甲醇,超声(40 kHz,200 W) 提取30 min,取出,放冷,滤过,用10 mL甲醇洗涤锥形瓶,滤过,合并滤液,滤液减压蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至5 mL 量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,经0.45 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。吸取各供试品溶液,在“2.3.1” 项条件下进样,记录105 min 的色谱图。

2.4 数据分析 采用Excel、SPSS 20.0 统计软件,进行单因素方差分析和聚类分析。

3 结果

3.1 浸出物与多糖含有量

3.1.1 单因素方差分析 运用SPSS 20.0 统计软件对党参药材、饮片及米炒党参的浸出物、多糖含有量进行单因素方差分析。结果,只有党参药材与米炒党参、饮片与米炒党参浸出物之间有统计学差异(P＜0.05)；党参药材、饮片及米炒党参的多糖含有量均值处于同一列,表明三者在多糖含有量方面无统计学差异(P＞0.05)。

3.1.2 质量等同性分析 为了进一步分析评价党参药材、饮片及米炒党参的质量,课题组参考文献[12],以浸出物、多糖含有量为指标,按饮片或米炒党参所测含有量占药材或饮片中含有量的比例,评价76 批7 个产地样品之间的质量等同性。结果,76 批样品在浸出物、多糖含有量方面的质量等同性较好,均大于90%,表明其大体一致,见表2。

表2 党参药材、党参饮片及米炒党参的质量等同性（%）Tab.2 Quality equivalence of Codonopsis Radix，Codonopsis Radix pieces and rice fried Codonopsis Radix （%）

3.1.3 聚类分析 采用SPSS 22.0 软件,以浸出物与多糖含有量为指标,对样品中同来源、同产地、同等级部位的21 批党参药材-饮片-米炒党参进行系统聚类分析。结果,按浸出物和多糖含有量聚类分析时未能将药材、饮片、米炒,表明浸出物和多糖含有量的差别不足以区三者见图1。

图1 21 批样品中浸出物及多糖含有量聚类分析Fig.1 Cluster analysis of the contents of extract and polysaccharide in twenty-one batches of samples

3.2 HPLC 指纹图谱

3.2.1 指纹图谱建立及指认 在“2.3.1” 项色谱条件下分别建立了党参药材(n=32)、党参饮片(n=36) 及米炒党参(n=8) 的HPLC 指纹图谱,采用国家药典委员会编写的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版) 软件进行分析,分别生成三者共有模式的对照指纹图谱R、R1、R2,包括7 个主要特征峰。通过对照品指认出5 个特征峰,即1 号峰为codonopyrrolidium B,3 号峰为京尼平苷,4 号峰为党参苷Ⅰ,5 号峰为党参炔苷,7号峰为苍术内酯Ⅲ,其中5 号峰峰面积相对较大,重复性好,故作为参照峰,标记为S。HPLC 指纹图谱及共有模式对照指纹图谱见图2～4。

图2 党参药材色谱图Fig.2 Chromatograms of Codonopsis Radix

图3 党参饮片色谱图Fig.3 Chromatograms of Codonopsis Radix pieces

图4 米炒党参色谱图Fig.4 Chromatograms of rice fried Codonopsis Radix

3.2.2 相似度分析 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版) 软件,分析党参药材、党参饮片及米炒党参对照指纹图谱的相似度。结果,党参药材与党参饮片、党参药材与米炒党参、党参饮片与米炒党参的相似度较高,分别为0.966、0.925、0.893,见表3、图5。

3.2.3 相对峰面积比较 采用SPSS 20.0 软件,比较党参药材、党参饮片及米炒党参7 个特征峰的相对峰面积。结果,党参药材与党参饮片3、4、6号峰相对峰面积有统计学差异(P＜0.05),见表4～5、图6。

表3 党参药材、党参饮片及米炒党参对照指纹图谱相似度比较Tab.3 Comparison of similarities among the reference fingerprints of Codonopsis Radix，Codonopsis Radix pieces and rice fried Codonopsis Radix

图5 党参药材、党参饮片及米炒党参对照指纹图谱Fig.5 Reference fingerprints of Codonopsis Radix，Codonopsis Radix pieces and rice fried Codonopsis Radix

表4 76 批样品7 个特征峰相对峰面积Tab.4 Relative peak areas of seven characteristic peaks of seventy-six batches of samples

3.2.4 聚类分析 采用SPSS 20.0 软件,以7 个特征峰相对峰面积为指标,对样品中同来源、同产地、同等级部位的21 批党参药材-饮片-米炒党参进行系统聚类分析。结果,按7 个特征峰的相对峰面积聚类时未能将三者区分开,不足以将其归类,见图7。

图6 76 批样品7 个特征峰相对峰面积比较Fig.6 Comparison of relative peak areas of seven characteristic peaks of seventy-six batches of samples

表5 76 批样品7 个特征峰相对峰面积的单因素方差分析Tab.5 One-way analysis of variance of seven characteristic peaks of seventy-six batches of samples

4 讨论

图7 7 个特征峰相对峰面积聚类分析Fig.7 Cluster analysis of relative peak areas of seven characteristic peaks

本研究是基于2020 年版《中国药典》 中对饮片的评价——“同药材” 的描述,以党参为例,从浸出物、多糖、HPLC 指纹图谱及特征峰相对峰面积3 方面进行党参药材-饮片-米炒党参的质量等同性研究。

4.1 浸出物 药材与米炒党参、饮片与米炒党参有统计学差异,而且从药材-饮片-米炒党参有下降的趋势,提示党参浸出物是评价党参质量的重要功能性指标,产地加工和米炒炮制对浸出物含有量有影响[13]。应加强对党参炮制工艺的研究,规范炮制工艺,避免浸出物流失,影响中药质量及疗效。但党参药材、饮片、米炒党参的质量等同性分析表明,党参饮片或米炒党参的醇浸出物含有量占药材或饮片中醇浸出物含有量的百分数均数都大于90%,表明党参药材-饮片-米炒党参的质量等同性较好。

4.2 多糖含有量 药材-饮片-米炒党参三者之间均无统计学差异,但有下降的趋势,这与文献[14-16]报道的米炒党参多糖含有量减少的结果一致。提示样品目前的产地加工和米炒炮制方法,对多糖含有量的影响不大。这与党参药材、饮片、米炒党参的质量等同性分析是一致的。

4.3 HPLC 指纹图谱 党参药材-饮片-米炒党参之间的HPLC 对照指纹图谱相似度均大于0.800[17],而党参药材与饮片在3 号、4 号及6 号峰相对峰面积方面有统计学差异,提示产地加工及炮制对三者的化学成分种类影响不大[18],但对药材-饮片二者之间的3 号(京尼平苷)、4 号(党参苷Ⅰ) 及6号峰(未知) 3 种成分的含有量有影响[19-20],有下降趋势。

实验前期对76 批样品以浸出物、多糖含有量、特征峰相对峰面积为指标,对党参药材、饮片及米炒党参样本进行系统聚类分析,但没有规律性结果。随后,对21 批不同产地的党参药材、饮片及米炒党参又进行系统聚类分析,还是未能将药材、饮片、米炒3 种党参分开,且3 种样品HPLC 对照指纹图谱的相似度在0.893～0.966 之间,提示浸出物、多糖含有量、7 个特征峰相对峰面积3 个指标,不足以聚类区分党参药材、饮片及米炒党参,后期将对党参药材、饮片及米炒党参的HPLC 特征峰进行进一步指认及定量研究。

综上所述,党参药材、饮片及米炒党参的质量等同性较好；2020 年版《中国药典》 一部中党参项下对饮片中浸出物的评价——“同药材” 的规定是合理的,但对米炒党参的规定,值得进一步研究；加工炮制对浸出物及HPLC 特征峰的含有量是有影响的。该研究为合理评价党参药材-饮片-米炒党参的质量提供了一种新思路,为党参的进一步加工炮制研究奠定了一定基础。