卵巢组织冻存移植安全性的研究进展

程姣姣 阮祥燕* 杜 娟 金凤羽 李扬璐 谷牧青

(首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京 100026)

由于肿瘤学、非肿瘤学和个人因素，女性对于生育力保护的需求急剧增加。卵巢刺激后成熟卵母细胞冷冻、胚胎冻存、卵巢组织冻存是美国生殖医学学会认可的生育力保护方法[1-3]。卵巢组织冻存对于青春期前女孩以及性腺毒性治疗无法延迟的女性是唯一的生育力保护方法[2-3]。全球已有超过200例婴儿通过卵巢组织冻存移植技术诞生[4]，冻存卵巢组织移植后约95%患者的卵巢功能可恢复至正常，妊娠率可高达50%，活产率和持续妊娠率约40%[5]，这些数据[6]表明了卵巢组织冻存移植技术的有效性。

但对于白血病、神经母细胞瘤、伯基特淋巴瘤等卵巢携癌高风险的患者来说[7-9]，卵巢组织移植风险高，可能需要通过其他方法恢复生育力。一些团队[10-11]已经为白血病患者进行卵巢组织移植且患者成功分娩，未见报道疾病复发。近几十年，为恢复生育力，并避免恶性细胞再移回体内的风险，世界各地的研究团队努力开发两种技术[9, 12]：体外培养卵巢组织[13]和人工卵巢移植[14-15](transplantable artificial ovary, TAO)。第一个指的是在体外实现整个卵泡发生过程，第二个是将分离的窦前卵泡移植回体内的自然环境。这些技术可提高所有冻存卵巢的患者的生育力。生育力保护体外技术的治疗潜力是巨大的，但技术是有挑战的。本文主要综述冻存卵巢组织移植安全性以及避免恶性细胞再移回体内新策略的研究进展。

1 卵巢组织冻存与移植概述

2020年，中国新发癌症患者470万例，位居世界第一[16]。随着肿瘤的早发现、早诊断、早治疗以及抗癌技术的进步与提高，癌症患者的5年生存率也明显提高[17]。因此癌症幸存者的生活质量以及生育需求越来越得到重视。胚胎冻存、卵母细胞冻存、卵巢组织冻存等是常用的生育力保护技术。相比于胚胎冻存、卵母细胞冻存，卵巢组织冻存不需要超促排卵，不延误患者后续的治疗，一片组织中可冻存成百上千个卵泡，不仅可以保护患者的生育力，还可以保护患者的卵巢内分泌功能[18]。此技术对于青春期前女童和放化疗无法延迟的女性来说是唯一的生育力保护技术[2-3]。

通过卵巢组织冻存移植技术，全球首例及第2例婴儿分别于2004年[19]和2005年[20]诞生。目前全球通过此项技术诞生的婴儿已超过200例，近期本团队报道了中国首例患者应用此技术后成功自然妊娠[21]。卵巢组织可移植回卵巢对应的腹膜袋中、剩余的卵巢内、剩余的卵巢上，可实现自然妊娠。如果盆腔经历大剂量的放射治疗(以下简称放疗)后血管供应差，可考虑上臂、大腿、腹肌处的异位移植，但异位移植的成功率低，可能是环境温度的不适应。移植的卵巢组织活性平均可持续2～5年，目前报道最长7年[5]。卵巢组织的存活时间与患者冻存时的年龄以及当时的卵巢储备功能等有关。

成人卵巢组织冻存移植的适应证中最常见的是血液恶性疾病(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病)和乳腺癌[2]。在儿童中，白血病和骨髓增生异常疾病往往占主导地位，其次是肉瘤[22]。到目前为止，还没有出现与卵巢组织移植相关的复发病例，再次引入恶性细胞的风险很低。因此，卵巢组织冻存移植技术是安全的，在目前的适应证下不会对健康构成威胁。

2 卵巢组织移植再携入癌细胞的高风险疾病

对于患有白血病、伯基特淋巴瘤等疾病的患者，卵巢组织中存在恶性细胞或者微小残留疾病(minimal residual disease, MRD)的可能性较高，尤其是在诊断时血液循环中有恶性细胞。多项研究[23-24]也已表明了白血病患者卵巢组织冻存、复苏与移植携癌风险很高。但目前卵巢组织冻存仍然是新诊断为白血病的患者保护生育力的主要策略，当患者开始化学药物治疗(以下简称化疗)后就不能采用胚胎或卵母细胞冻存了，但化疗通常需要在诊断后立即开始。相比于冻卵，在化疗开始后收集卵巢组织是可能的，因为非生长的卵泡是静止的，对化疗的致畸性损伤不敏感[25]。

已有研究[10]显示，白血病幸存者可通过卵巢组织移植后分娩且没有后续疾病复发。卵巢组织取材尽可能是在最安全的时间，一般倾向于完全缓解时。血液系统恶性肿瘤中，在患者对治疗出现反应后，以及在疾病负担或微小残留疾病已大大减少时收集组织，可将卵巢组织的潜在恶性污染降至最低[26]。在一系列研究中，31例接受了冻融卵巢组织自体移植的患者中有22例(71%)在组织取材前有过化疗暴露。自体卵巢组织移植后3年累积妊娠率总计为36%(95%CI为17.4～63.7)，其中49%的患者有过先前的化疗暴露，与无先前化疗暴露的患者相比差异无统计学意义[27]。当然，即使从完全缓解的患者身上取出用于冻存的卵巢，也不能完全排除携癌细胞的风险[9, 28]。未来如能有不需要卵巢组织移植而能利用冻存卵巢组织的技术，如始基卵泡的体外成熟[29]以及可移植的人工卵巢[30]，可明显提高卵巢携癌风险高的患者的生育力保护。

从冻存的卵巢组织中分离无白血病细胞的未成熟卵泡被认为是可行的。然而，始基卵泡的体外成熟或者它们在人造卵巢中的移植目前还未用于人类，也不能作为自体移植的替代[13]。当白血病幸存者考虑卵巢组织移植时，详尽的组织评估对于提高移植安全性是必要的[26]。而且，患者需知晓目前检测技术的局限以及个体权衡想要生物学后代的愿望与疾病复发的风险[25]。

3 避免恶性细胞再移回体内的新策略

全球研究团队一直致力于开发两种可安全恢复无法进行卵巢组织移植患者的生殖功能的技术：(1)分离的窦前卵泡以可移植人工卵巢的形式移植回体内生长[30]；(2)分离卵泡的体外生长[29]。基本上，这两种技术方法都是将窦前卵泡从卵巢组织中分离出来，然后在体内或体外进行卵泡发育。

3.1 可移植的人工卵巢

人工卵巢是天然卵巢的临时替代物，分离的卵泡和卵巢基质细胞包裹在生物材料中。主要目标是安全的移植卵巢卵泡，确保性激素的分泌和可受精的成熟卵母细胞的发育。为了设计人工卵巢，最重要的是卵泡。因此，在患者开始癌症治疗之前对卵巢组织进行取材，可进行卵巢组织冻存，也可以用来分离可冻存的窦前卵泡。无论何种卵泡分离方法，均需要鉴定细胞悬液中有无恶性细胞[31-32]。为此，Soares等[33]设计了一种采用重复洗涤过程来清除恶性细胞的特定方案。人工卵巢的第二个组成部分是卵巢细胞，当患者痊愈时，新鲜的间质和内皮细胞可以从癌症治疗后的第二次卵巢取材中收集[34]。也可以分离冻存卵巢组织中的卵巢细胞，但采集新鲜卵巢组织中的卵巢细胞可避免将恶性细胞添加到人造卵巢基质中，而且冻存后的卵巢细胞可能没有新鲜卵巢组织中的卵巢细胞有活力，虽然化疗会损伤卵母细胞的存活和发育，但似乎对卵巢细胞没有负面影响[15]。卵泡和卵巢细胞将被包裹在一个基质中，基质主要是为了给卵泡提供结构性支持，且便于处理和移植。因此，这3个部分将组成人工卵巢，在癌症治愈后可移植回患者体内。

生理上，卵巢中所有卵泡周围有一层特殊的细胞外基质，即基底膜。在成人的卵巢卵泡中，基底膜主要由IV型胶原、层粘连蛋白以及少量的纤维连接蛋白和蛋白多糖组成[35]，在卵泡发育过程中其组成和厚度也在变化[36]。基底膜的存在可防止卵泡被恶性细胞污染。从卵巢组织中应尽可能多的分离出完整卵泡，人原始卵泡和初级卵泡主要分布在卵巢皮质中，其非常致密，富含胶原，安全有效地卵泡分离程序现在对人类应用是可行的，为了获得高产量和高质量的卵泡，最有效的方法通常依赖于机械和酶组织消化的组合[37]。分离过程中注意保持卵泡基底膜的完整性，可以通过显微镜监测。Chiti等[38]优化卵泡分离方案，将卵巢组织消化分成3个时间段(30、60和90 min)，采用的方法为机械法和酶消化法(Liberase DH和DNase I)，并引入过滤以取出已分离的卵泡，然后进一步分离未消化的组织片段，总体上获得了更高的卵泡产量，移植一周后卵泡恢复率(35%)高于之前的研究(20%)[39]。

早期卵泡发育受卵巢自分泌/旁分泌调节因子的控制，并且已知基质细胞释放各种正向调节原始卵泡向初级卵泡转变的因子。在原始卵泡被激活后，初级卵泡分泌其他因子来招募基质细胞分化为功能性膜细胞，这些细胞参与卵泡的生长，并为颗粒细胞合成雌激素提供类固醇合成前体。因此，将卵巢基质细胞添加到人工卵巢中可以重建卵泡和周围基质细胞之间的交互作用，潜在地促进卵泡发育。血管化也是卵泡存活和生长的关键，因此移植后血管发育是必需的[40]。内皮细胞可通过增强移植后的血运重建来促进细胞存活，分离的内皮细胞与基质细胞共移植可促进移植组织的血管化[41]。总之，分离的卵巢细胞具有体内增殖、降解支架和合成新的细胞外基质的潜能，使其能够在人工卵巢中为分离的卵泡提供结构支持。

人工卵巢的支架在植入后应该具有生物相容性和可降解性，以便卵泡能够发育、迁移、增殖和血管生成[42]。此外，支架材料必须符合生物安全和临床兼容标准。从广泛的生物材料中开发合适的支架来包裹卵泡并支持其发育仍然是一个挑战。在卵泡发育过程中，卵泡从原始卵泡(0.03 mm)到成熟卵泡(18～24 mm)呈指数级增长，需要大量的卵巢细胞和血管来支持卵泡发育。天然的支架材料包括海藻酸钠、胶原、纤维蛋白、血浆凝块以及脱细胞卵巢细胞外基质，合成的材料如聚乙二醇[30]。合成聚合物允许为临床应用量身定做机械性能，但它们不包含细胞黏附所需的分子，尽管可以添加生物活性因子来刺激细胞黏附。相反，天然聚合物含有生物功能分子，显示出与细胞良好的相互作用，在细胞黏附、迁移、增殖和分化过程中起重要作用[43]。

一种采用小鼠原始卵泡制作的新型3D打印人工卵巢已被证明可用在小鼠身上并成功分娩健康幼崽[44]。目前需要进一步的研究将技术应用于制造人类的人工卵巢并将其应用于临床实践。为了更好地应用人工卵巢，需要更深入地了解冷冻保存后卵巢的力学、生物化学特性和卵泡发生，更好的体内成像技术来观察移植支架的血管化和降解，才能有效地进行临床应用[43]。

3.2 体外培养

体外培养始基卵泡是另一项新技术，也避免了自体移植携癌风险高的卵巢组织。冻存的卵巢组织中主要含有原始卵泡，但也提供了从小的窦卵泡中获得未成熟卵母细胞的可能。因此，在不适合移植的情况下，通过从生长中的卵泡中提取卵母细胞进行体外成熟(in vitro maturation, IVM)，或者通过原始卵泡的完全体外生长(in vitro growth, IVG)和成熟(IVGM)为第二次减数分裂中期(MII)卵母细胞，可以在体外安全地恢复生育力。IVM和IVG方法的发展可以支持卵巢组织中所有阶段的卵母细胞，将最大限度地发挥所有接受生育力保护的患者的潜力[45]。但这一领域的进展是谨慎的，要找到最佳的培养基和条件来促进人始基卵泡的高效体外培养是一项艰巨的工作。

IVG和IVGM以及随后体外受精(in vitro fertilization, IVF)已成功应用在小鼠上并成功分娩其后代[46]。成功的小鼠卵母细胞/卵泡IVG系统的开发突出了对支持人类卵泡IVG的多步培养系统的需求。卵泡发育的每个阶段，从原始卵泡激活生长到成熟，都需要不断变化的条件，因此需要一个动态的培养系统来支持3个主要的过渡步骤：①始基卵泡的激活；②生长卵泡的分离和培养，以实现卵母细胞的生长和发育；③卵泡环境的去除和卵丘卵母细胞复合体的成熟。IVM已成功应用于人类卵母细胞，并取得了不同程度的进展[47-48]。任何IVG系统的终点都是产生具有发育能力和表观遗传学正常的卵母细胞；因此，未来的研究需要集中于优化每个阶段，并进一步了解IVG卵母细胞和任何形成的胚胎的表观遗传学状态。McLaughlin等[49]已经成功地使人类始基卵泡生长和成熟到窦前、窦卵泡和MII期，提供了证明人类卵母细胞的完全发育可以在体外发生的概念。IVG卵母细胞的形态评价和受精潜力需要进一步优化，以确定其是否正常。不同年龄和青春期成熟阶段的卵泡数量差异有统计学意义，青春期前女孩的卵泡在体外表现出与成人不同的生长轨迹[50]，为成人组织开发的培养系统可能不适合青春期前女孩，需要针对特定年龄段调整和完善培养体系。因此，体外培养在临床应用之前还需要做更多的工作。

4 小结与展望

现在有足够的证据支持卵巢组织冻存和移植以恢复生育力的可行性和有效性。然而，一些担忧仍然阻碍了卵巢组织移植在所有患者中的应用。在一些癌症中，存在将恶性细胞与卵巢组织一起重新移植入体内的风险。近年来，研究人员已经制定了许多策略来解决这些问题。可移植人工卵巢的成功在很大程度上取决于对卵泡发生的生物学机制的理解，以及卵泡与细胞外基质的相互作用以维持和发育合适的卵泡。因此，找到最合适的支架来容纳分离的卵泡是至关重要的。另一个关键问题是在临床应用之前，确定分离和移植对人类卵泡是否有表观遗传学影响。人工卵巢还有其他重要用途，例如，可以辅助对卵泡发育的理解，以及在毒性学研究中的应用可解释不同药物对生殖的影响。它还可以为研究卵原干细胞和评估它们重新启动人类配子发生的能力提供一个合适的环境。人工卵巢的发展将是生殖组织工程领域的革命性一步。

如果可靠的方法能够体外产生可受精的成熟的人卵母细胞，这将是一个可行的替代自体卵巢组织移植的方法。除了各种IVG系统的临床意义和潜力外，它们中的每一个系统都提供了进入人类卵子发生过程的实验上容易处理的辅助样本。通过这些系统，我们将更好地了解人类卵母细胞的发育，最终改善生育力的保存。