Xpert Ultra超敏结核分枝杆菌基因检测技术的临床应用

天津市海河医院（300222）韩东

1 概述

结核病(T B)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染所造成的传染性疾病，在全球感染人数众多，我国不但是全球结核病严重流行的国家之一，同时也是耐多药结核病(MDR-TB)严重流行的国家[1]。结核病主要的诊断方法包括抗酸杆菌涂片染色镜检法和结核分枝杆菌培养法。抗酸染色镜检法应用广泛，快速经济，但灵敏度较低；结核分枝杆菌培养法为结核病诊断的金标准，但耗时较长，无法快速获得结果，往往延误疾病的诊治。

在过去的几十年里，使用聚合酶链反应（polyrnerase chain reaction，P CR）从临床标本中直接检测结核分枝杆菌的DNA，使结核病的微生物诊断技术水平得到了显著地提高。Xpert MTB/RIF (Xpert)检测技术是一种以聚合酶链反应(PCR)原理为基础的体外诊断技术，通过核酸提取、扩增和检测，将处理后的待检标本放入密闭的反应盒中，通过上述三位一体操作程序自动检出痰标本是否菌阳、荷菌量多少，以及是否对利福平耐药。这极大地缩短了检测时间， 可以使确诊患者更早的应用抗结核药物[2]，Xpert 比抗酸杆菌涂片染色镜检法更敏感、特异性更高，被世界卫生组织(WHO)推荐为结核病的快速诊断方法[3]，但是Xpert同样也存在着许多的不足，由于Xpert的检测限（LOD）为131菌落形成单位(cFU)／ml，相较于培养的LOD仅为1-10(cFU)／ml，其敏感性低于结核菌培养，除此之外Xpert的利福平耐药性检测还会出现假阳性的结果[4][5]。因此在2017年3月WHO推荐了一种新的检测方法Xpert Ultra，这种检测方法对结核分枝杆菌DNA检测的敏感性更高，rpoB基因突变检测的特异性更强，显著提高了结核病的诊断水平。本文通过分析最新研究结果，比较了Xpert和Xpert Ultra在不同结核病发病地区以及不同发病部位中的表现，来讨论Xpert Ultra在临床工作中的的应用。

2 Xpert Ultra在肺结核诊断中的应用

2.1 敏感性 一项通过对五个国家的回顾性研究，比较了277例呼吸道标本中结核分枝杆菌的检测结果，在培养阳性的标本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性分别为88.7%和81%，在涂片阳性培养阳性的标本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性是98.9%和97.8%，在涂片阴性培养阳性的标本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性是78.9%和66.1%。在一项包括2368名参与者的前瞻性多中心研究中，在培养阳性的标本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性分别为88%和83%，涂片阴性培养阳性的标本中Xpert Ultra和xpert的敏感性是63%和46%[6]。这些数据显示在涂片阳性标本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性无明显差异，但在涂片阴性标本中Xpert Ultra的灵敏度更高。在结核病低流行地区进行的一项研究也得到了类似的结果，培养阳性的标本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性是95.7%和82.9%，涂片阳性培养阳性的标本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性都是100%，涂片阴性培养阳性的标本中Xpert Ul tra和Xpert的敏感性是91.8%和66.7%，这表明Xpert Ultra对含菌量低标本的敏感性更高。这一优势有助于提高例如粟粒性结核、结核性胸膜炎、结核性脑膜炎或早期结核菌感染等情况下，含菌量较低的临床标本的诊断率[7]。尤其在HIV感染患者中，结核病患病率及死亡率均高于普通人群[8][9]，因此对于此类患者结核菌感染的检测十分重要。一项研究观察到，在HIV阴性患者中，Xpert Ultra和Xpert的敏感性为别91%和90%，并无显著差异，但在HIV阳性患者中，Xpert Ultra的敏感性仍维持在90%，Xpert的敏感性却下降到了77%[6]。在另外一项研究中也同样发现，HIV阴性患者中，Xpert Ultra相较于Xpert并无显著优势，但在HIV阳性患者中，Xpert Ultra的敏感性增加了11.7%[10]，更高的检测敏感性可以帮助患者更早地接受抗结核治疗，降低致死率。

儿科病人的敏感性：对于儿童人群的结核病诊断十分具有挑战性。在一项包含453名符合条件儿童的研究中，Xpert Ultra对于呼吸道标本的敏感性和特异性分别为75.3%和96.9%[11]。对于感染HIV的儿童和未感染者HIV的儿童，Xpert Ultra的敏感性相似；在这项研究中，HIV的感染率为19.4%。不同的参考标准会得到不同的结果，当以呼吸道标本的培养结果作为参考时，Xpert Ultra和Xpert在呼吸道标本上测定的灵敏度分别为65.8%和64.4%。当以包含Xpert、Xpert Ultra、培养以及临床资料的综合信息作为参考时，Xpert Ultra的敏感性为73.7%，高于Xpert的63.2%[13]。在坦桑尼亚的另一项包含两个中心研究中，培养阳性标本的Xpert Ultra灵敏度达到64.3%，相比于Xpert 的53.6%，Xpert Ultra在灵敏度上更为领先。同时在所有可用的标本中，相当于平均每个病人2.46和2.11个样本，Xpert Ultra和Xpert的灵敏度分别为75%和60.7%[12]。对于这两种检测方法，仅检测首次标本时，特异性均为100%；但对于所有测试标本，Xpert Ultra的特异性为98.1%；Xpert的特异性仍为100%。在HIV未感染患者中，Xpert Ultra和Xpert的敏感性并没有显著差异，分别为52.6%和47.4%。相反的，在HIV感染患者中，Xpert Ultra的敏感度为88.9%，明显高于Xpert 66.7%的敏感度。这项研究表明，与Xpert相比，Xpert Ultra的敏感性更高，尤其是在HIV阳性的儿童患者中，而这部分儿童患者可以占到所有研究患者总数的52%，比例相当的高[12]。

2.2 特异性 在结核病高发病率地区进行的几项研究表明，以结核菌培养结果为参照标准，与Xpert相比，Xpert Ultra的敏感性虽然增加，但与Xpert 98.7%的特异性相比，Xpert Ultra的特异性略有降低至96%[8]。基于聚合酶链反应可以检测到标本中在抗结核药物治疗后杀死的结核杆菌以及既往存在结核病史患者残存的结核菌DNA，因此无法区分标本中的结核菌是死的杆菌还是活的杆菌，从而影响测试特异性的准确性[13][14][15]，而这种情况更可能发生在检测敏感性更高的Xpert Ultra中，这也解释了为何其特异性较Xpert略低。此外，与肺结核低发病率的地区相比，高发病率地区由于患者既往肺结核病史发生率更高，从而更容易导致检测特异性的降低[8][16]。Xpert Ultra的检测结果在原来Xpert的“高、中、低、极低”4个级别的基础上增加了“微量”，共5个级别。Xpert检测中不存在“微量”这个类别，与该类别相对应的是多拷贝基因IS6110和IS1810阳性以及单拷贝基因rpoB阴性的PCR样本，“微量”类别的出现是LOD提升的结果，会导致检测特异性降低。Xpert Ultra检测中“微量”结果表示检测到极少量结核分枝杆菌DNA，有助于区分以前感染的死杆菌和正在进行的活动性肺结核，但需要注意的是当检测值为“微量”时，利福平的耐药性无法判断，这与Xpert Ultra的耐药性检测机制相关。

3 Xpert Ultra在肺外结核诊断中的应用

许多研究都表明Xpert对于肺外结核的诊断结果可能会因为被测样本的不同而有所不同。最近的一项关于Xpert的研究表明：脑脊液检测结核菌的敏感性和特异性为71.1%和98%，胸腔积液的敏感性和特异性分别为50.9%和99.2%，而尿样的敏感性和特异性为82.7%和98.7%[17]。到目前为止，有关Xpert Ultra对肺外结核诊断的研究还比较少。其中一项研究只选择了涂片阴性的标本进行研究，其标本总体敏感性和特异性分别为75.9%和100%，另外的研究[18][19]显示在含菌量较低的标本中，胸腔积液的敏感性仅为60.5%，其他部位的标本中脑脊液的敏感性为100%（3/3），关节液的敏感性为87.5%（7/8），腹腔积液的敏感性为33.3%（1/3），心包积液的敏感性为66.6%（2/3），尿液标本的敏感性为100%（12/12）。在这个研究中所有被检测标本的特异性均为100%。然而，由于样本数量较少，本文所得到的结果需要通过包含更多样本的研究去进一步验证。在一项包括200例肺外结核患者的回顾性研究中，Xpert Ultra和Xpert的总体敏感性分别为83.7%和67.4%，特异性为92%和96%，研究中包括103例胸腔积液标本，其中Xpert Ultra和Xpert的检出率分别为43.7%和20.4%，研究中还包括71个组织穿刺标本，Xpert Ultra和Xpert的检出率分别为78.9%和63.4%，略高于胸水。在另外一项包含108名患者的研究中，其胸腔积液样本的Xpert Ultra和Xpert敏感性分别为61.11%和34.26%。国内关于Xpert Ultra对于肺外结核标本的检测研究还比较少见，但先前的一系列关于Xpert在肺外结核标本中的研究[20][21]均显示其敏感性不足。

结核性脑膜炎是一种危及生命的肺外结核疾病，对于它的诊断仍然非常具有挑战性，延误诊治会导致死亡率增高，在艾滋病感染患者中尤其明显[22]。由于结核性脑膜炎是一种含菌量较低的结核感染，所以对于脑脊液的微生物诊断敏感性不高。最初Xpert Ultra和Xpert并不被推荐应用于脑脊液的微生物检测，但一些研究也在尝试两者在脑脊液中的应用，在一项包含43例HIV阴性结核性脑膜炎患者的研究中，Xpert的敏感性为18.60%，而Xpert Ultra的敏感性较Xpert提高了44.19%。在另一项包含23例HIV阳性结核性脑膜炎患者的研究中，Xpert Ultra和Xper的敏感性分别为70%和43%。同时这项研究还强调结核性脑膜炎的脑脊液结核菌培养阳性率非常低[23]。在这项研究中，只使用了1ml离心的脑脊液用于Xpert和Xpert Ultra检测，而微生物诊断与标本得量是呈正相关的，但在实际工作中常常无法获得大量的脑脊液标本，这也是结核性脑膜炎诊断具有挑战性的另一个原因。国内的另一项研究表明，在同样使用1～2ml脑脊液标本进行检测时，Xpert Ultra的检测敏感性显著高于Xpert，这也表明Xpert Ultra更适用于实际临床工作中。

总之，这些数据表明Xpert Ul tra较Xpert对于肺外结核的诊断敏感性更高。然而值得注意的是，这些测试结果在不同标本中存在较大差异，且由于研究的数量以及其包含的样本数量均有限，其准确性仍需要更多的样本去进一步验证。

4 利福平耐药检测

Xpert的主要局限性是在利福平耐药性检测中出现的假阳性结果，研究发现在MDR-TB<5%以及MDR-TB>15%范围内利福平耐药检测阳性预测值在70%～90%之间[4][24]，这是因为利福平耐药性的检测依赖于rpoB基因81 bp区域特异性DNA探针的缺失突变，而这种突变更容易出现在含菌量较少的样本中。在Xpert Ultra中，检测原理由半定量半巢式循环阈值的比较变为半定量巢式聚合酶链反应，运用了高分辨率熔解曲线技术，可更好地区分ropB突变种类，因此提高了利福平耐药性检测的准确性，降低了假阳性结果的几率[6]。

由于两种测试都针对单拷贝基因rpoB，Xpert Ultra和Xpert检测利福平耐药的灵敏度相似（92.7%～95%），同时Xpert Ultra对利福平耐药检测的特异性为98%和Xpert 99%的特异性并没有显著差异[8]。所以我们有必要对更多含菌量较低，相应的也包含DNA含量更低的结核分枝杆菌标本进行研究，以评估新的耐药检测技术的可靠性。

5 结论

Xpert以及最近出现的Xpert Ultra正在被越来越多的应用于临床工作中，仔细了解这两种检测方法的优势及其局限性十分重要，本文对比较Xpert Ultra和Xpert两种检测技术性能的相关文献进行了回顾。Xpert技术拥有较高的敏感度和特异性，可以精准、迅速地检测出利福平耐药基因（ropB突变基因），在临床上对结核病的诊断上发挥了重要的意义，同时显著提升了利福平耐药性和MDR-TB 的检测水平，不足的是虽然Xpert检测痰标本总的敏感度很高，但对含菌量较少的标本检测的敏感度较低。Xpert Ultra将检测目的基因ropB的5条探针增加到6条探针，降低了Xpert MTB/RIF Ultra的LOD，使其接近于培养，提高了在菌量较少情况下的敏感性，因此Xpert Ultra的整体灵敏度高于Xpert，尤其对结核性胸膜炎和菌阴结核等含菌量较低标本[8][21]。

作为一种基于PCR的检测方法，在既往结核病病史患者的非活动结核杆菌中，Xpert Ultra仍能够检测出相应DNA，这种假阳性结果的出现会导致检测特异性降低，而这种特异性降低在结核病高发地区更容易出现[11]，所以在临床工作中遇到结核病复治的患者，需要全面地分析患者的病史、症状、体征、影像学检查以及其他实验室检查等，不能单独以Xpert Ultra结果确定患者是否存在活动性。

到目前为止，评估Xpert Ultra肺外结核诊断价值的文献相对较少，涉及的样本数量也相对有限，绝大多数的研究对象大多是呼吸道标本，因此对于呼吸道以外标本进行检测，其结果的准确性及参考价值仍需谨慎对待。

对于利福平耐药性进行的研究并未发现Xpert Ultra在检测敏感性以及特异性方面有所提高。由于PCR检测的目标基因仍然是单拷贝基因rpoB，并未预期其在敏感性方面能有所提高，但相比之下，由于引入了高分辨率熔解曲线技术，预计其特异性会有所提高，但和Xpert之间仍未出现明显差异，造成这种结果的原因可能是由于Xpert Ultra技术的检测优势在含菌量较低标本中更加明显，相应的也就是在耐多药结核病发病率低的地区，而迄今为止，大多数研究都是在耐多药结核病发病率较高的地区进行的。

综上所述，Xpert Ultra在HIV阳性肺结核、结核性脑膜炎或结核性胸膜炎等标本含菌量较低的情况下，对于结核病诊断敏感性显著提高。Xpert Ultra技术总体提升了结核病的诊断水平，但是需要注意的是阴性的Xpert Ultra检测结果仍不能完全排除结核病。尽管结核菌培养同样存在假阴性的情况，但培养仍是结核病诊断的重要参考指标之一。因此，临床工作中需要结合患者的临床特点，微生物学检测结果以及诸如Xpert Ultra这类新的PCR检测技术的结果综合分析，使结核病的诊断更加可靠。