凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫功能的影响

申维维，吴 琼，胡 迪，吴显平，温海京，胡 婷，范矿士，张永红，崔德凤

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室/动物类国家级实验教学示范中心，北京102206)

随着人们生活质量的提高，畜牧业产品的安全问题越来越受到重视。目前中国畜牧养殖生产中仍存在对抗生素、化学药物、激素等超量且不合理使用现象，长期下来致使畜禽产品安全性降低[1]，特别是采食抗生素的动物体内会形成大量抗性基因，这种基因会随着动物粪便污染周边环境甚至土壤进入生物链，经过食物链进入人体，间接对人类健康形成威胁，抗生素的耐药性及其在动物产品中的残留威胁人类健康。益生菌作为一种优势菌，属于对宿主有益的活性微生物，不仅可以调节肠道内微生物体系，还能保护机体肠道不受侵害[2]，在肠道中扮演十分重要的角色。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans，BC)拥有乳酸菌类益生菌与芽孢菌类益生菌两类的共同优点[3]，可以保存较长时间，在室温且避光的环境中其有效作用可长达720 d，主要具有耐热、耐氧、耐盐、耐酸碱等“四耐”的抗逆特性[4-5]。益生菌作为抗生素的潜在替代品已经成为研究热点，郭欣怡等[6]在肉仔鸡饲喂中加入益生菌，益生菌组肉鸡免疫器官质量与系数增加且显著高于空白对照组，益生菌提高肉仔鸡的免疫功能。刘淑娇等[7]在肉鸡基础日粮中添加复合益生菌，益生菌组肉鸡血清中总蛋白和免疫球蛋白IGg含量显著增加。该试验以肉鸡为研究对象，其饲养过程中饲料中分别添加凝结芽孢杆菌和抗生素，以抗生素为参照，探讨凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫功能的影响，目的为实际养殖中抗生素的使用寻找替代品提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans，BC)由北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室保存，3日龄健康雄性肉鸡购自北京爱拔益加家禽育种有限公司，鸡IL-10和鸡IgG试剂盒购自雨桐生物公司，D-Hank's购自Gibco公司，淋巴细胞分离液购自biowest公司，1640培养液购自博尔优生物公司，MTT购自Millipore，刀豆蛋白(ConA)购自索莱宝公司。

超净工作台(东联哈尔制造公司)、电热恒温培养箱、全温振荡培养箱(上海一恒科学仪器公司)、酶标仪(北京普朗新技术有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 试验分组与肉鸡饲养 取肉鸡75只经过3 d适应性饲养后随机分5组，即空白对照组、抗生素组、BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组。空白对照组肉鸡饲喂基础日粮，抗生素组肉鸡饲喂基础日粮加杆菌肽(4 g/10 kg)，BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡饲喂基础日粮加凝结芽孢杆菌(活菌数分别为2×107、2×108、2×109CFU/mL)。每组3个重复。试验采用无抗生素添加的基础日粮(表1)，试验周期为35 d，7 d为一个周期。

1.2.2 肉鸡饲养管理 购进试验肉鸡之前对鸡舍进行全面冲洗、消毒，进雏鸡前2 d对鸡舍进行照射升温。肉鸡分层饲养，每天人工给料1次，自由采食，自由饮水，鸡舍内照射热灯，保障鸡舍内适宜的温度和湿度，注意保障鸡舍卫生及合理通风。

1.2.3 样品采集与检测 试验期第7天、第14天、第21天、第28天、第35天时对肉鸡称量体质量，同时每组取3只肉鸡心脏采血3～4 mL分别置于一支含有抗凝剂(肝素)采血管(用于T淋巴细胞提取)和另一只不加肝素采血管，不加肝素采血管室温

表1 基础日粮组成及营养水平Tab.1 Basic diet composition and nutrition level

斜面放置0.5 h，3 000 r/min离心10 min，吸取血清置于灭菌1.5 mL EP管内，采用血清生理生化分析仪检测生理生化相关指标，按照试剂盒说明操作检测血清中IL-10和IgG含量。

剖杀肉鸡取出脾脏、胸腺、法氏囊，用滤纸轻轻擦拭表面称量质量，按照公式计算脏器指数=脏器质量(g)/肉鸡体质量(g)。

1.2.4 T淋巴细胞转化率测定 取1 mL的Hanks液于离心管中，加入1 mL全血混匀，将其缓慢加入装有2 mL淋巴分离液离心管内，2 000 r/min离心20 min，取出离心管用毛细管吸取中间层白色絮状装于有15 mL 1640培养液离心管中，2 000 r/min离心5 min，用1640培养液洗涤，离心，重复2次，弃去培养液，最后用1640培养液将细胞稀释到2×106个/mL，加入96孔细胞培养板，空白对照孔加入50 μL细胞悬液+50 μL的1640培养液，试验组孔加入50 μL细胞悬液+50 μL的ConA，置于细胞培养箱分别培养24、48、72、96 h，取出细胞板每孔加20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h，每孔加DMSO溶液100 μL，将细胞板置于酶标仪460 nm下检测，记录吸光度值。

1.2.5 数据统计分析 应用SPSS 20.0软件对试验数据进行分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P<0.001表示差异非常显著，文中与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与抗生素组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

2 结 果

2.1 凝结芽孢杆菌对肉鸡体质量和免疫器官指数的影响

凝结芽孢杆菌对肉鸡体质量和免疫器官指数的影响见图1和表2。试验期14 d时BC高剂量组肉鸡日增体质量显著高于抗生素组(P<0.05)，试验期21 d时抗生素组、BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡日增体质量均非常显著高于空白对照组(P<0.001)，试验期28 d时抗生素组和BC中剂量组肉鸡日增体质量显著高于空白对照组，试验期35 d时 BC中剂量组肉鸡日增体质量极显著高于空白对照组(P<0.01)；整个试验期内抗生素组与BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组相比肉鸡日增体质量没有显著差异(P>0.05)。试验前期第14 天之后抗生素组与BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组均表现出显著提高肉鸡平均日增体质量的作用，且随着试验期延长BC中剂量组肉鸡日增体质量提高显著，BC中剂量促进肉鸡生长效果显著。

试验期21 d和28 d时，BC中剂量组肉鸡法氏囊指数与空白对照组存在显著差异，试验期BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡法氏囊指数均高于抗生素组；试验期14、21、28 d时BC中剂量组肉鸡脾脏指数均显著高于空白对照组，且在试验期BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡脾脏指数均高于空白对照组；试验期7、14、21、28 d时BC中剂量组胸腺指数显著高于空白对照组，在试验期BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组胸腺指数均高于空白对照组。

表2 凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫器官指数的影响Tab.2 Effects of Bacillus coagulans on immune organ index of broilers

2.2 凝结芽孢杆菌对肉鸡T淋巴细胞转化的影响

试验期第7天、第14天时BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡血液T淋巴细胞培养72 h时，T淋巴细胞转化率显著提高(图2A、图2B)；试验期14 d时BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡血液T淋巴细胞培养96 h时，T淋巴细胞转化率继续提高，且BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组T淋巴细胞转化率均显著高于空白对照组和抗生素组(图2B)，随着肉鸡饲喂凝结芽孢杆菌时间延长，凝结芽孢杆菌对T淋巴细胞转化的促进作用提高；试验28 d时的T淋巴细胞培养48 h后转化增加(图2D)；试验期21 d、35 d时，T淋巴细胞转化率均有提高，其中BC低剂量组、BC高剂量组肉鸡血液T淋巴细胞转化率提高效果更显著，BC中剂量同样也有促进作用(图2C、图2E)。

2.3 凝结芽孢杆菌对肉鸡血液生化指标的影响

试验期间，肉鸡血液生化指标空白对照组与抗生素组之间没有显著差异(P>0.05)，BC低剂量组丙氨酸氨基转化酶活性显著高于空白对照组(P<0.05)，BC高剂量组尿素含量极显著高于空白对照组(P<0.01)见表3。

2.4 凝结芽孢杆菌对肉鸡血液细胞因子IL-10及抗体IgG水平的影响

试验期14 d时BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡血清中IL-10含量达到最高值，且BC高剂量组IL-10含量最高，与空白对照组与抗生素组差异非常显著(图3)。试验期14 d时BC高剂量组肉鸡血清中IgG含量最高，与空白对照组差异显著，随着试验时间延长，组间血清中IgG含量差异逐渐缩小(图4)。

血液生化指标Blood biochemical index空白对照组Blank control group抗生素组Antibiotic groupBC低剂量组BC low dose groupBC中剂量组BC medium dose groupBC高剂量组BC high dose group丙氨酸氨基转化酶ALT/(U/L)5.00±2.004.00±2.287.60±0.49*5.80±1.334.80±1.47谷草转氨酶AST/(U/L)145.40±46.06153.40±19.20148.20±50.53148.40±52.10177.60±49.42碱性磷酸酶ALP/(U/L)1244.20±438.36941.40±167.171657.40±258.92892.00±323.03984.80±502.76总蛋白TP/(g/L)13.20±5.069.84±4.8313.34±4.6110.76±4.0614.56±7.88白蛋白ALB/(g/L)10.16±1.679.40±0.709.48±2.149.20±1.019.44±1.73尿素Urea/(mmol/L)0.80±0.130.90±0.061.00±0.140.94±0.191.38±0.21肌酐Crea(mmol/L)5.74±4.372.30±2.054.96±4.103.72±1.506.36±0.88**

3 讨 论

无菌动物体内的淋巴器官发育迟缓，将其置于有菌环境中淋巴器官发育状况有所好转，体内正常的菌群结构有助于机体内免疫器官的发育[8]。该试验期14、21、28 d时BC中剂量组肉鸡免疫器官指数显著增加，凝结芽孢杆菌可以提高肉鸡免疫器官的发育，而试验期35 d时BC中剂量组胸腺指数逐渐下降，这可能由于凝结芽孢杆菌在肠道中大量繁殖，肉鸡前期饲养过程中凝结芽孢杆菌刺激免疫器官的生长发育，但随着肉鸡机体的发育成熟，免疫器官和消化器官的发育趋于稳定，凝结芽孢杆菌刺激其生长发育的作用逐渐降低，与前人报道一致[9]。当机体内的淋巴细胞受到抗原等因素刺激，其会逐渐转变成一种母细胞，这是淋巴细胞转化的主要途径[10]。淋巴细胞的转化率是机体免疫水平的一把标尺，当淋巴细胞转化率增强时，免疫细胞活性也会随之增强，共同达到提高机体免疫水平的作用[11-12]。该试验肉鸡养殖过程中饲料中加入2×107CFU/mL和2×109CFU/mL凝结芽孢杆菌时，BC低剂量组、BC高剂量组肉鸡T淋巴细胞转化率提高，凝结芽孢杆菌提高肉鸡免疫水平。IL-10属于一种来源广且功能多的细胞因子，IL-10是淋巴结、脾脏细胞生长的复合因子，其可有效抑制促炎因子的产生而抑制炎症反应，促进免疫细胞的增殖分化[13]。机体血清中主要由免疫球蛋白IgG占比最多，这种免疫球蛋白占总含量的70%左右，通过检测免疫球蛋白IgG的含量可以反映出机体免疫能力的强弱。该试验中BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组14 d肉鸡血清中IL-10含量高且免疫球蛋白IgG含量最高，凝结芽孢杆菌可以促进机体产生免疫球蛋白抗体的分泌，从而提高肉鸡机体的免疫能力。

肝脏和肾脏分别是异源物质在机体进行转化和代谢的主要场所。血浆谷草转氨酶、丙氨酸氨基转化酶和碱性磷酸酶等酶类活性能反映肝脏细胞受损情况及严重程度。谷草转氨酶和丙氨酸氨基转化酶主要位于肝细胞胞浆水溶性部分或线粒体中，活性增高常提示肝细胞破坏、细胞膜通透性增强或线粒体损伤。碱性磷酸酶是一种去磷酸化酶，与磷酸化的激酶作用相反，其可阻止核酸、蛋白等的磷酸化，进而影响DNA合成和细胞中信号转导。一定范围内的血清丙氨酸氨基转化酶活性表示肝细胞代谢的活跃程度，该试验中BC低剂量组丙氨酸氨基转化酶活性显著高于空白对照组，说明该剂量在一定程度上对肝脏功能产生不利影响，损伤机制尚需进一步研究；碱性磷酸酶主要来源肝脏和骨骼，因此检测碱性磷酸酶的含量可以反映出肝脏和骨骼的状态[14]。除此之外，碱性磷酸酶还能保护肠黏膜的完整性，抵御病原菌对肠道的损害[15]，各组之间谷草转氨酶、碱性磷酸酶活性与总蛋白、白蛋白、尿素含量无显著差异，且在正常范围值之内，说明该试验采用的凝结芽孢杆菌具有一定的可饲喂安全性。林丽花等[16]试验证明，凝结芽孢杆菌显著提高黄羽鸡血清中碱性磷酸酶的活性。总蛋白是检测机体营养状况的重要指标[17]。肌酐是肌肉中磷酸肌酸的终末代谢产物，不能被重吸收，经肾小球过滤后排出体外。血浆肌酐的浓度变化反映肾小球的滤过能力。通过测定尿素，可以了解肾小球的滤过功能。它主要是经肾小球滤过，并随尿液排出体外。当肾实质受损害时，肾小球滤过率降低，血液中血清尿素氮的浓度就会增加。该试验中BC高剂量组肌酐含量极显著高于空白对照组，丁金雪等[13]试验表明空白对照组肉鸡肌酐在27.82 mmol/L±2.46 mmol/L时，仍处于正常范围内，因此该试验各个试验组肉鸡肌酐处于正常范围内。

凝结芽孢杆菌通过增强T淋巴细胞转化，促进细胞因子分泌及免疫抗体产生，提高免疫器官指数来提高肉鸡的免疫功能，其中以凝结芽孢杆菌2×108CFU/mL时提高机体免疫作用最显著且效果优于杆菌肽。