大豆黑斑病病原菌鉴定

王 佳，任俊达，李玮瑜，尚巧霞*

(1.北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2.北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室/植物生产国家级实验教学示范中心，北京 102206)

大豆(Glycinemax (Linn.))原产于中国，种植历史悠久，在世界各地广泛种植，是重要的油粮饲兼用作物[1-3]。

大豆黑斑病是链格孢属真菌(Alternariasp.)引起的一种常见病害，在世界各大豆种植区普遍发生，中国吉林、黑龙江、辽宁、四川、湖北、山西、安徽、江苏和浙江等多个省份的大豆产区均有发生报道[4-10]。该病害在田间主要危害大豆叶片、豆粒和豆荚，常在植株生长后期发生，偶有危害幼嫩植株。链格孢能够产生毒素，不仅对大豆植株有致病性，影响植株的生长、降低大豆品质和产量，而且带有毒素的大豆籽粒对人或牲畜具有诱变性、致癌性和致畸性等毒性作用，对其健康构成威胁[11-12]。

随着种植品种、栽培方式、田间管理措施等方面的变化，个别年份有些地区的黑斑病对大豆植株的危害严重[13]。1994年中国黑龙江省大豆黑斑病大面积发生，发病株率100%，造成大豆减产60%以上[13]。2016年大豆黑斑病在中国辽宁省的发病率达48%[14]。

2019年8—9月，笔者在北京市顺义区和山西省晋中市太古县大豆种植田调查发现大量感染黑斑病的大豆植株，发病植株的叶片和豆荚上产生形状不一的褐色病斑，叶片上病斑连接成片、出现穿孔，严重植株叶片干枯脱落、豆荚出现瘪粒。田间黑斑病发病率达30%～60%，严重影响结荚期的大豆植株生长，目前未见北京和山西地区大豆黑斑病的病原种类的报道[15-16]。笔者对引起北京和山西部分地区大豆黑斑病的病原菌进行分离鉴定和致病性测定，对该病的研究和防治具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年8—9月分别于北京市顺义区和山西省晋中市太古县大豆种植田采集具有典型黑斑病症状的大豆叶片、现场拍照，做好调查记录后样品置于4 ℃冰箱保存。

1.2 病原菌的分离培养与纯化

采用组织分离法从新鲜病叶上选取具有典型症状的单个病斑，用解剖刀从病健交界处切取大小为5 mm×5 mm病组织。经75%乙醇处理30 s后用NaClO处理3 min，无菌水连续漂洗3次，再用灭菌滤纸吸去组织表面多余的水分，移入PDA平板中央，进行28 ℃培养[17-18]。

采用琼胶平板表面单孢子挑取法对分离到的病原菌进行纯化[17]。

1.3 病原菌的形态学鉴定

观察并记录病原菌菌落、分生孢子、厚垣孢子和菌丝的形态特征[18]。

1.4 病原菌的分子生物学鉴定及分子序列分析

利用植物基因组DNA快速提取试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司)对病原菌纯培养菌丝DNA进行提取，用引物ITS1/ITS4对ITS基因片段进行PCR扩增，反应条件为预变性95 ℃ 4 min；变性95 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸7 min[18-19]。PCR扩增产物用0.1%琼脂糖凝胶电泳检测，北京博迈德基因技术有限公司对其测序。将所得序列于NCBI进行同源性比对，并使用MEGA7.0的最大简约法(Maximum parsimony)构建系统进化发育树[2]。

1.5 病原菌的致病性测定

采用菌丝块接种法对纯化的病原菌进行致病性测定[20-21]。将品种为‘黑大豆’大小一致的离体大豆健康叶片放入70%酒精表面处理1 min，从纯化的病原菌菌落边缘上取直径为5 mm的菌饼，刺伤接种到叶片上，对照为刺伤接种无菌PDA块的叶片，28 ℃保湿培养。观察发病症状，当大豆叶片发病后开始拍照并记录，再次取发病的病组织进行分离纯化，比较其是否与最初分离到的病原菌一致。

2 结果与分析

2.1 典型病害症状

该病害在田间普遍发生，主要危害大豆叶片，也可危害豆荚。叶片染病，初期形成褐色病斑，呈圆形至不规则形状，且病斑周围有明显的黄色至橘黄色晕圈；发病后期，病斑扩大相互连接成片，甚至出现穿孔，最终叶片干枯脱落。豆荚染病，形成椭圆形至不规则形状的黑褐色病斑，严重时完全变成黑褐色，出现瘪粒(图1)。

2.2 病原菌的形态学鉴定

分别从北京和山西部分地区各采集5片具有大豆黑斑病典型症状的病叶进行病原菌分离培养，5 d后用琼胶平板表面单孢子挑取法进行纯化，得到相同的病原菌菌株。

菌落初期为白色绒毛状，后变橄榄绿色至墨绿色，最后为黑褐色，边缘乳白色呈不规则形状，且生长缓慢(图2)。

利用光学显微镜观察，菌丝有隔，且具有分枝，宽3.0～4.5 μm。分生孢子呈倒棒形或椭圆形，暗褐色，无嘴喙或甚短，(13.5～26.0) μm×(6.5～12.0) μm，有横膈膜1～3个，纵膈膜1～2个。厚垣孢子球形或近球形，单生，橄榄色，直径14.0～18.0 μm(图3)。该病原菌与标准链格孢的形态特征描述相吻合，因此将其初步鉴定为链格孢(Alternariaalternata)。

2.3 病原菌的分子生物学鉴定及序列分析

进一步选取分离得到的病原菌进行分子生物学鉴定，利用引物ITS1/ITS4对其DNA进行PCR扩增，得到ITS基因片段，大小为561 bp。使用NCBI进行核苷酸序列比对分析，ITS基因序列(GenBank登录号：MT027104.1)与A.alternata(GenBank登录号：MN646267.1)的一致性为100%。用Maximum parsimony法以ITS基因序列构建系统发育树表明，与A.alternata(GenBank登录号：MN646267.1)亲缘关系较近(图4)。该次调查的北京和山西部分地区引起大豆黑斑的病原菌为链格孢(Alternariaalternata)。

2.4 病原菌的致病性测定

将病原菌刺伤接种到3片‘黑大豆’的叶片上，

接种3 d后，‘黑大豆’的叶片产生浅褐色圆形或不规则小斑，中间颜色略深，随后逐渐发展成褐色病斑，并连接成片，斑点数量逐渐增加，有晕圈(图5)。对照组的叶片没有病斑。刺伤接种叶片均发病，且与自然发病症状相同，从该发病叶片上分离出的病原菌与所接种的病原菌形态特征和ITS基因序列相同。

通过对分离得到的大豆黑斑病病原菌进行形态学特征鉴定、ITS基因序列分析及致病性测定，北京和山西部分地区大豆黑斑病由链格孢(Alternariaalternata)引起。

3 讨 论

中国大豆黑斑病的病原有A.alternata、A.tenuissima和A.brassicae，可导致大豆叶片和豆荚产生不同的症状[6]。笔者对北京和山西部分地区发生的大豆黑斑病的症状进行比较分析，并对病原菌进行分离鉴定和致病性测定，北京和山西部分地区大豆黑斑病病原菌均为A.alternata，但是否存在其他种类的链格孢菌侵染发病的情况，还有待于进一步调查研究。

A.alternata寄主范围广泛、侵染力强和传播途径多，可引起多种经济作物病害，如马铃薯早疫病、番茄黑斑病、棉花轮纹病、烟草赤星病、梨黑斑病、枣缩果病、生菜黑斑病、甜瓜黑斑病、茶树链格孢叶斑病等，影响经济作物的品质和产量，给农业生产带来严重的经济损失[18,22-28]。开展早期的预防诊断，筛选抗性种质资源，采用多种防治措施，可降低链格孢对农业生产造成的危害并减少损失。