板栗胚性愈伤组织对遗传霉素敏感性的研究

孙佳晨，高月荣，李晓伟，曹庆芹，邢 宇，房克凤，张 卿，秦 岭*

(北京农学院a.植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，b.园林学院，北京 102206)

板栗(CastaneamollissimaBlume)为壳斗科(Fagaceae)栗属(Castanea)植物。中国板栗栽培广泛[1]，其果实营养丰富，熟食味道香糯可口，老少皆宜，深受人们喜爱。板栗栽培品种大多存在产量低、抗病虫害性差、不耐盐碱等问题，因此需要培育出一批产量高、抗性好的新品种[2]。目前，通过板栗体细胞胚遗传转化体系已能获得板栗转基因植株。而抗生素筛选是转基因过程中获得阳性植株的重要步骤。该课题组前期进行板栗胚性愈伤组织对卡那霉素的敏感性研究，确定卡那霉素对板栗胚性愈伤组织筛选的质量浓度为180 mg/L，并应用于后续转基因材料的筛选[3]。由于板栗愈伤组织本身具有较强的卡那霉素抗性，在筛选过程中存在周期长、效果不明显等问题，因此该研究试图用更为适宜的遗传霉素(G418)代替卡那霉素进行筛选，探究板栗胚性愈伤组织对遗传霉素的敏感性。

遗传霉素是一类氨基糖苷类抗生素，其结构类似于新霉素和卡那霉素，可干扰真核细胞80S核糖体功能，使蛋白合成受阻，进而导致真核细胞死亡。转基因载体上通常具有筛选标记基因nptⅡ(新霉素磷酸转移酶基因)，其编码的氨基糖苷磷酸转移酶可使新霉素、卡那霉素和遗传霉素等被磷酸化而失活，从而使转基因细胞表现出对新霉素、卡那霉素和遗传霉素的抗性[4]。遗传霉素在水稻、甘蔗、矮牵牛、木瓜等抗性筛选中的应用已有一些报道[5-11]。如王紫萱等[5]研究表明，遗传霉素对籼稻胚性愈伤组织的筛选质量浓度为150 mg/L；宁露云等[8]证明诱导矮牵牛不定芽的遗传霉素临界质量浓度为4 mg/L。可见不同物种细胞对遗传霉素的敏感性可能不同，所使用的遗传霉素筛选质量浓度差异较大。

该研究以板栗体细胞胚稳定遗传转化体系为基础，探究两种板栗胚性愈伤组织在添加不同质量浓度遗传霉素的固体培养基上培养30 d时，导致其全部褐化死亡的最低质量浓度。为了进一步加快筛选进程，探究两种板栗胚性愈伤组织在添加不同质量浓度遗传霉素的液体培养基上悬浮培养15 d时，导致其全部褐化死亡的最低质量浓度。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 ‘燕山红栗’(CastaneamollissimaBlume ‘Yanshanhongli’)种植于北京市怀柔区板栗试验站。两种状态的胚性愈伤组织均诱导自‘燕山红栗’第1次盛花期后45～55 d的一个幼胚，分别为细小、泥状的难形成球形胚的胚性愈伤组织(embryogenic callus-difficult to form globular embryo，EC-D)和粒大、质硬、分散的易形成球形胚的胚性愈伤组织(embryogenic callus-easy to form globular embryo，EC-E)。

1.1.2 培养基 扩繁培养基(WPM 2.3 g/L，Nitsch & Nitsch Vitamins 109 mg/L，2,4-D 1.8 μmol/L，6-BA 1.1 μmol/L，蔗糖30 g/L，Casein 1 g/L，植物凝胶3 g/L，pH=5.55±0.05)。参考Lu等[12]愈伤组织扩繁方法。

1.1.3 试剂和设备 生长素(2,4-D)、细胞分裂素(6-BA)购自Sigma公司，WPM(McCown‘s Woody Plant Medium)、Nitsch & Nitsch Vitamins、植物凝胶、蔗糖等购自Phyto Technology Laboratories公司，遗传霉素购自Invitrogen。6 cm培养皿、尖镊、37 μm的滤网等均购自北京华佰泰生物科技有限公司。

遗传霉素储存液(50 mg/mL)：0.5 g遗传霉素溶于10 mL无菌ddH2O中，-20 ℃保存。

Sanyo MLS-3780型高压湿热灭菌锅、体视显微镜(ZEISS SteREO Discovery.V20)、超净工作台(ZHJH-C1115C)。

1.2 试验方法

1.2.1 板栗愈伤组织的固体培养 参考Lu等[12]愈伤组织扩繁方法，将扩繁培养基上保存的EC-D和EC-E，分别转接到含有不同质量浓度遗传霉素的固体扩繁培养基上暗培养，培养皿直径为6 cm，每个培养皿均含有20团愈伤组织，每个质量浓度重复3次，培养温度为23～25 ℃，每14 d更换1次培养基。每10 d观察1次愈伤组织状态并拍照，连续培养30 d后统计愈伤组织死亡情况。

1.2.2 板栗愈伤组织的液体悬浮培养 称取在扩繁培养基上保存的EC-E 0.3 g和EC-D 0.1 g，分别转接到50 mL含有不同质量浓度遗传霉素的液体扩繁培养基上，每个质量浓度重复3次，100 r/min，悬浮暗培养15 d后，用孔径为37 μm的滤网将愈伤组织滤出并用滤纸吸干水分，拍照观察愈伤组织状态，并称质量统计愈伤组织的鲜质量变化量。

1.2.3 遗传霉素质量浓度的设置 固体培养中遗传霉素质量浓度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、130、140 mg/L。悬浮培养中遗传霉素质量浓度为0、10、20、30、40、50、60、70、80 mg/L。每个质量浓度重复3次。

1.2.4 计算方法 死亡率=愈伤组织死亡团数/愈伤组织总团数

鲜质量变化量=培养后胚性愈伤组织鲜质量-培养前胚性愈伤组织鲜质量

2 结果与分析

2.1 固体培养条件下板栗胚性愈伤组织对遗传霉素的耐受力

通过观察EC-E和EC-D在含有不同质量浓度遗传霉素的固体培养基上的死亡情况，统计EC-E和EC-D培养30 d时的死亡率。

当遗传霉素质量浓度<60 mg/L时，EC-E未出现死亡情况；≥60 mg/L，EC-E逐渐开始出现死亡；80～90 mg/L，EC-E的死亡率急剧升高；之后随着遗传霉素质量浓度的升高，EC-E的死亡率缓慢上升(图1)。当遗传霉素质量浓度为0～120 mg/L，且培养时间相同时，EC-E的褐化程度随着遗传霉素质量浓度的增加而不断加深，且培养30 d时，均可见新生EC-E；当遗传霉素质量浓度≥130 mg/L时，培养30 d，未见新生EC-E(图2)，EC-E的死亡率达到100%(图1)。

当遗传霉素质量浓度<50 mg/L，EC-D未出现死亡情况；≥50 mg/L，EC-D开始逐渐出现死亡；60～80 mg/L，EC-D的死亡率急剧升高(图1)。当遗传霉素质量浓度为0～70 mg/L，且培养时间相同时，EC-D的褐化程度随遗传霉素质量浓度的升高而加深，且培养30 d时，均可见新生EC-D；当遗传霉素质量浓度≥80 mg/L，培养时间为20～30 d时，均未见新生EC-D(图3)，EC-D的死亡率达到100%(图1)。

综上所述，说明固体培养30 d时，遗传霉素对EC-E的最低致死质量浓度为130 mg/L，对EC-D的最低致死质量浓度为80 mg/L。

2.2 悬浮培养条件下板栗胚性愈伤组织对遗传霉素的耐受力

将两种胚性愈伤组织分别接入50 mL含不同质量浓度遗传霉素的液体扩繁培养基中，悬浮暗培养15 d，统计其鲜质量变化量并拍照记录其褐化情况。

当遗传霉素质量浓度为0～20 mg/L时，EC-E生长量迅速下降，且在20 mg/L时，EC-E开始失重；>20 mg/L时，生长量变化不明显(图4)；20～60 mg/L时，随着遗传霉素质量浓度的升高，EC-E褐化程度逐渐加深，并且其生长明显受到抑制(图5)；≥60 mg/L，EC-E完全褐化死亡(图5)。

当遗传霉素质量浓度为0～10 mg/L时，EC-D生长量急剧下降，且在10 mg/L时，EC-D开始失重；>10 mg/L时，EC-D生长量变化不明显(图4)；10～30 mg/L时，随着遗传霉素质量浓度的升高，EC-D褐化程度逐渐加深，并且其生长明显受到抑制(图5)；≥30 mg/L，EC-D完全褐化死亡(图5)。

综上所述，说明液体悬浮培养15 d时，遗传霉素对EC-E的最低致死质量浓度为60 mg/L，对EC-D的最低致死质量浓度为30 mg/L。

3 讨 论

同种植物材料对不同抗生素的耐受力是不同的。如王亚君等[13]研究表明埃式小球藻对11种抗生素的敏感性均不同；杜春梅等[14]研究表明毛木耳对4种抗生素的敏感性不同；葡萄体细胞胚对头孢和潮霉素的敏感性不同[15]；板栗胚性愈伤组织对头孢、特美汀、卡那霉素的敏感性不同[3]，因此为了优化板栗转基因的筛选进程，探究板栗胚性愈伤组织对遗传霉素的敏感性是很有必要的。

在植物组织培养过程中，与固体培养方式相比，液体培养方式会使愈伤组织培养材料更均一化，并且可以加快愈伤组织扩繁速度[16]。该试验中同一种状态的板栗胚性愈伤组织在不同培养条件下，表现出对遗传霉素不同的耐受力。在固体培养时板栗胚性愈伤组织对遗传霉素的耐受力高于悬浮培养，出现这种差异的原因可能是固体培养条件下，愈伤组织对培养基的接触不充分，只能靠愈伤组织的生理压吸收遗传霉素，而在悬浮培养条件下，愈伤组织对遗传霉素全方位进行吸收，从而导致同一种状态的板栗胚性愈伤组织在固体培养和悬浮培养时对遗传霉素的耐受力有很大差异。

相关研究证明不同植物材料或同一植物不同生长阶段对相同抗生素的抗性不同。例如刘家仪等[17]在甘蔗品种ROC22的组织培养中探索遗传霉素的使用质量浓度，确定甘蔗愈伤组织生长阶段的最佳遗传霉素筛选质量浓度为20 mg/L，分化阶段的最佳遗传霉素筛选质量浓度为40 mg/L，小苗生根阶段的最佳遗传霉素筛选质量浓度为30 mg/L；苦荞的愈伤组织在后期分化时对卡那霉素很敏感[18]；齐仙惠等[19]证明不同品系的大白菜对卡那霉素的耐受力不同；张静等[20]确定2种萝卜的种子自交系的最佳卡那霉素筛选质量浓度分别为150 mg/L和300 mg/L；押辉远等[21]研究表明小麦品种豫卖18的转基因遗传霉素筛选质量浓度为25 mg/L。该研究所用的板栗两种状态的胚性愈伤组织在相同培养条件下，表现出对遗传霉素不同的耐受力，出现这种差异的原因可能是胚性愈伤组织本身的差异所致，EC-D呈细小，泥状，形态不规则，EC-E粒大，质硬，形态规则，这可能会导致EC-D较EC-E接触培养基更充分，更易吸收遗传霉素，从而导致EC-D对遗传霉素耐受力更低。另外，该研究仅仅探讨遗传霉素在板栗转基因抗性愈伤组织筛选过程中的耐受力，而遗传霉素在抗性愈伤组织诱导分化成转基因植株过程中的使用还有待探讨。该研究结果为板栗主栽品种‘燕山红栗’胚性愈伤组织转基因过程中遗传霉素的使用提供参考。