钝叶酢浆草的离体培养与快速繁育研究

邱凯男，张 杰，宋婷婷

(北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

钝叶酢浆草(Oxalisobtusa)属于酢浆草科酢浆草属，广布于非洲纳米比亚的纳马夸兰区和克尼斯纳区，生长在砂土或黏土中，株高10～35 cm，全株被有疏柔毛，茎短缩，叶基生，莲座状，掌状复叶，3小叶，倒心形，小叶无柄，形状大小略有不同。花单生，颜色丰富，在不同的光照条件和温度下有不同的花色，是秋季、冬季、早春不可多得的中小型花卉[1-2]。

钝叶酢浆草具有独特的叶形花色，可盆栽种植[3]，作为年宵花供应市场。盆栽可摆放于广场、花坛、花台或布置岩石园，钝叶酢浆草是中国南方全部生育期可以在露地栽培的地被[4]，生长迅速，覆盖力强[5]。如今，钝叶酢浆草已经走进各个园艺爱好者的视野并受到追捧[6]，目前只在网络电商中出售种球和盆栽，鳞茎按照规格不同从2～50元不等，盆栽根据品种从15～100元不等，部分新品种能卖出数百元的价格。繁育困难，供不应求，是其市场价格走高的主要因素。

目前仅有少量酢浆草专类玩家培育部分种内杂交品种[7]，而对其相关研究少之又少。现今，对于酢浆草属组织培养的研究大部分集中在紫叶酢浆草(Oxalistriangularis)上[7-15]，另有研究者研究熔岩酢浆草(Oxalisspiralissubsp.vulcanicola)的组培快繁技术[16]，还有部分研究者研究山酢浆草(Oxalisacetosella)的组织培养体系[17]；对于钝叶酢浆草的研究仅仅停留在种群鉴别上。研究者发现不同产地的钝叶酢浆草间存在生殖隔离[18-19]，解释钝叶酢浆草杂交苗培育的困难。而对于钝叶酢浆草的组织培养仍没有研究者涉足。

园艺师为了创造更多花色的品种，会对钝叶酢浆草进行杂交，但钝叶酢浆草为异形花柱[2]，不易结实，部分品种存在生殖隔离[19]，种子是顽拗性种子，不耐失水，杂交种子采收后要立即播种，发芽率低，发芽不整齐[2]，在中国部分播种苗无法形成鳞茎直接枯萎死亡。生产中钝叶酢浆草通常使用鳞茎繁殖。可是钝叶酢浆草收获的鳞茎尺寸不均，不便标准化生产，储藏时易失水死亡。以上问题是钝叶酢浆草批量生产和工厂化育苗的瓶颈。

为了建立钝叶酢浆草通用性强，生长繁殖速度快的组织培养体系，该试验以杂交钝叶酢浆草的叶片和茎尖为外植体，在含有不同质量浓度激素的培养基上进行组培研究。旨在获得钝叶酢浆草的完整繁殖体系，提高其种苗质量，为钝叶酢浆草的深入研究提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

选取购买于北京四环花木中心的钝叶酢浆草‘锂辉石’(Oxalisobtuse‘Kunzite’)、钝叶酢浆草‘芬达’(Oxalisobtusa‘Fanta’)、钝叶酢浆草‘大花’(Oxalisobtuse‘large form’)长势相近、发育正常的植株茎尖和叶片为试验材料。材料放置于北京农学院实验楼组培室内培养，环境条件设置：光照14 h/d，光照强度2 000 lx，温度25 ℃±2 ℃，湿度50%～55%左右。

1.2 材料处理

选择盛花期、无病虫害的钝叶酢浆草植株的叶片和茎尖为繁殖材料。将选取的茎尖和叶片用2%表面活性剂溶液浸泡2 min，流水冲洗40～60 min，75%酒精处理15 s。将叶片分为3组，分别用2%NaClO溶液浸泡5、10和15 min，无菌水冲洗2次，叶片切成大小0.5 cm2左右，茎尖切成大小0.5 cm，备用。

1.3 启动培养

试验以MS培养基为基本培养基，在萘乙酸(NAA)质量浓度保持不变的情况下，每增加0.5 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)的质量浓度设置一组培养基，设置6个试验组(表1)。将经过消毒处理的叶片接种到6组培养基中，每个培养基接种9片叶，设置5次重复。将经过消毒处理的茎尖接种到6组培养基中，每个培养基接种6段茎尖，设置5次重复。将完成接种的培养基放入组培室内暗培养，28 d后转为光培养。每隔7 d观察记录外植体、愈伤组织的生长状态及出愈率，选出最佳外植体、启动培养基和消毒时间。

表1 不同质量浓度激素的钝叶酢浆草初代培养基的配制Tab.1 Preparation of Oxalis obtusa primary medium with different hormone concentrations

1.4 继代培养

试验设置NAA质量浓度为0.1 mg/L和0.2 mg/L两大组，每一大组内设置6-BA 1.0、1.5和2.0 mg/L 3组，共计6组(表2)。经过初代培养的外植体长出芽后，将其分别接种到6组继代培养基上，每个培养瓶接种5个芽，设置5次重复，在继代培养基进行培养。每隔7 d观察记录芽的生长情况，选出最佳继代培养基，待芽生长到一定规格后移入生根培养基中。

表2 不同质量浓度激素的钝叶酢浆草继代培养基的配制Tab.2 Preparation of Oxalis obtusa subculture medium with different concentrations of hormones

1.5 生根培养

试验以1/2 MS培养基为基本培养基，设置6-BA质量浓度为0 mg/L和0.5 mg/L两大组，每一大组内设置NAA 0.05、0.10和0.15 mg/L，共计6组(表3)。将生长达到5 cm的芽移入6组生根培养基中，每个培养皿接种5个芽，设置5次重复，观察植株变化情况，待根系生长至一定长度后进行炼苗。

表3 不同质量浓度激素的钝叶酢浆草生根培养基的配制Tab.3 Preparation of root medium Oxalis obtusa with different concentrations of hormones

1.6 炼苗与移栽

组培苗根系长度达到5 cm以上，打开培养瓶进行炼苗。首先在温室内半阴处轻轻旋松瓶盖2 d，保证培养瓶内外的气体交换，然后完全开盖2 d，在自然光下开瓶炼苗3 d。最后将泥炭、珍珠岩和蛭石按照2∶1∶1比例混合作为基质，种植组培苗，并逐步转入日常管理。

2 结果与分析

2.1 最适消毒时间的选择

将3种钝叶酢浆草的外植体暗培养28 d后，统计最适消毒时间，见表4和图1及图2。‘大花’钝叶酢浆草叶片是3个品种中表现最好的，其余两个品种存活率低不做统计。用75%酒精和2%NaClO溶液浸泡10 min的消毒方法最好，外植体成活率高达74.0%，且长出大量愈伤组织，有利于后期植株生长。用75%酒精和2%NaClO溶液浸泡15 min的消毒方法外植体无菌率最高，达80.0%，但成活的外植体没有长出愈伤组织，且褐化、黄化严重，失去生命力，如图1所示。而用75%酒精和2%NaClO溶液浸泡5 min的消毒方法外植体损伤最小，但污染率最高，不利于后期无菌操作，如图2所示。

表4 不同消毒方法对‘大花’钝叶酢浆草外植体的影响Tab.4 Effects of different disinfection methods on explants of Oxalis obtuse ‘large form’

2.2 最适启动培养基的选择及最适外植体的选取

3种钝叶酢浆草的外植体暗培养28 d后，转入光培养7 d，并对生长情况进行统计。不同质量浓度激素配比导致各培养基外植体生长情况不同，其中‘大花’钝叶酢浆草的表现最明显，对其进行数据统计(表5)。A2到A5各组不同程度诱导出愈伤组织，其中A4组愈伤组织饱满，呈松散状，表面透明，有绿色的芽点出现，生长良好，利于分化，最为优秀。A1组外植体萎缩，没有分化出愈伤组织。A2组外植体褪色，愈伤组织排列紧密，半透明，呈白色，没有芽点。A3组愈伤组织排列紧密，呈浅黄色，分化趋势很慢。A5组愈伤组织浅绿色，没有芽点，松散程度介于A3组、A4组之间。A6组外植体饱满，但没有分化出愈伤组织和芽点。6组茎尖全部成活，状态饱满，但污染严重。通过比较，A4组长势最快，茎尖中心长出新叶，新叶叶柄伸长，叶片展开，生长良好，最为优秀。A2组和A5组茎尖生长缓慢。A3组茎尖长出新叶，但新叶仍皱缩。A1组和A6组的茎尖没有生长。通过比较，A4组的钝叶酢浆草愈伤组织和茎尖生长最好，如图3所示。A1组和A6组的茎尖没有生长。采用MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+30 g/L琼脂的配方为钝叶酢浆草最适启动培养基。培养时，茎尖的污染状况较叶片更严重。钝叶酢浆草茎尖不适宜作为外植体。而钝叶酢浆草叶片消毒效果好，是启动培养的最佳外植体。

表5 不同启动培养基对‘大花’钝叶酢浆草外植体的影响Tab.5 Effects of different primary medium on explants of Oxalis obtuse ‘large form’

2.3 不同品种在最适启动培养基中的生长情况

暗培养28 d后，统计3种钝叶酢浆草愈伤组织的分化情况。不同品种在同种激素配比下外植体出愈率不同(表6)。通过比较，叶片最厚质地最硬的‘大花’钝叶酢浆草出愈率最高，在A4组中高达66.7%。‘锂辉石’钝叶酢浆草叶片较厚，质地较软，在A4组出愈率为51.8%，而叶片较薄质地最软的‘芬达’钝叶酢浆草出愈率较低，只有22.2%。3个品种的培养状态如图4所示。在激素配比相同时，钝叶酢浆草叶片越厚、质地越硬，更易分化出愈伤组织，更适宜植物组织培养。

表6 3个品种钝叶酢浆草在同种激素配比下外植体出愈率Tab.6 The germination rate of 3 varieties of Oxalis obtusa explants under the same hormone concentration

2.4 最适继代培养基的选择

在NAA为0.1 mg/L时，随着6-BA质量浓度升高，钝叶酢浆草芽的生长速度加快，分枝增加(表7)。其中，B3组芽生长速度最快，长出的分枝较多，同时芽高度适中，茎直立健壮，长势最优。B1组芽生长较快但分枝极少。B2组芽生长较快，芽分支少，茎直立。而当NAA为0.2 mg/L时，随着6-BA质量浓度升高，钝叶酢浆草芽的生长速度略微加快，但分枝形态弯曲无法利用。B4组芽生长很慢，分枝少，茎高而扭曲。B5组芽生长较慢，分枝少，茎弯曲。B6组生长较快，芽分枝较多，但形态扭曲难以分离。MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+30 g/L琼脂，是培养钝叶酢浆草的最适继代培养基。

表7 不同继代培养基对钝叶酢浆草外植体的影响Tab.7 Effects of different subculture medium on explants of Oxalis obtusa

2.5 最适生根培养基的选择

在6-BA质量浓度为0.0 mg/L时，随着NAA质量浓度升高，钝叶酢浆草根的生长速度加快(表8)。其中C2组根密而粗壮，叶绿色，植株健壮，长势最好。C1组植株较弱，根密且细弱，叶浅绿。C3组植株较细弱，根稀而粗壮，叶浅绿。

在6-BA质量浓度为0.5 mg/L时，随着NAA质量浓度升高，钝叶酢浆草根的生长情况被明显抑制，植株状态差。其中C4组植株细弱，根系稀疏，叶黄。C5组植株很弱，只有零星根系长出，叶黄。C6组没有分化出根系，叶黄。采用1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+30 g/L琼脂的培养基是钝叶酢浆草的最适生根培养基，培养得到的苗在炼苗时损失少，移栽容易恢复，叶片深绿且生长快，如图5所示。

表8 不同生根培养基对钝叶酢浆草无菌苗的影响Tab.8 Effects of different root medium on sterile seedlings of Oxalis obtuse

3 讨 论

钝叶酢浆草组织培养的外植体选择很重要，一般选用叶片或茎尖，其中茎尖消毒不便、易污染[17]，而叶片消毒操作简便，污染率低，因此钝叶酢浆草组织培养的最适外植体是叶片。胡国富等[12]确定培养三角紫叶酢浆草的最适外植体为叶片。陈芬等[16]以熔岩酢浆草叶片为外植体研究得出组培快繁技术。该试验使用叶片为外植体进行培养与前人研究结果一致。

该试验确定钝叶酢浆草叶片的最适消毒方法，75%酒精浸泡15 s后用2%NaClO溶液浸泡10 min的消毒效果最好，外植体成活率最高。消毒时间短，外植体不易损伤，但无法杀死杂菌，通常长出乳白色或淡黄色菌落。其中为了使叶片更清洁，用流水冲洗叶片时间应加长到40 min至60 min，冲洗时水流适中，防止叶片损伤。在选取的3个品种中，叶片的质地越硬出愈率越高。叶片最硬最厚的‘大花’叶片平整、绒毛少，能紧密贴合培养基，在各组培养基中发芽率最高，长势最好。叶片最薄、质地最软的‘芬达’在各组培养基的出愈率都不理想。消毒时间长，薄叶片的品种易受伤害，受害叶片背面呈海绵状，质地软、易碎，操作困难，出愈率低，部分叶片褪色，培养时易黄化、褐化。而厚叶片的品种在消毒后受到的损伤小，便于划伤培养。钝叶酢浆草叶片厚、质地硬的品种更适宜植物组织培养。

不同质量浓度的激素配比导致外植体在启动培养、继代培养和生根培养过程中产生不同的生长情况。启动培养中，NAA和6-BA对钝叶酢浆草叶片愈伤组织的形成起到关键作用。高贵珍等[20]在紫叶酢浆草组织培养中确定启动培养基激素配比为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，外植体接种10 d后即可产生愈伤组织，诱导率83.3%。而在该试验当NAA质量浓度保持不变时，随着6-BA的质量浓度渐渐升高，其对钝叶酢浆草外植体分化趋势越来越强。当6-BA的质量浓度超过临界值2.0 mg/L时，6-BA质量浓度逐渐升高，钝叶酢浆草茎愈伤组织排列紧密，不利出芽。当6-BA质量浓度2.5 mg/L，NAA质量浓度0.2 mg/L时，叶片不会长出愈伤组织，茎尖也不会生长。该试验将启动培养基激素配比调整为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。继代培养中，NAA诱导钝叶酢浆草植株长出不定根，6-BA促进茎叶伸长和诱导侧芽生成。蔡丽琼等[21]、张兴桃[22]等在紫叶酢浆草组织培养中确定继代培养基激素配比为NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，不定芽增殖系数最高，达3.46±0.61。而该试验过程中，当NAA质量浓度0.1 mg/L时，钝叶酢浆草再生芽生长速度随着6-BA质量浓度增加而加快，形态直立健壮。当NAA质量浓度0.2 mg/L时，再生芽生长速度随着6-BA质量浓度增加而加快，生长旺盛但形态发生不可逆转的扭曲；可见只有二者处于合适的比例时，外植体才能快速大量产生愈伤组织，并加以诱导产生可用的再生芽，因此该试验最佳继代培养为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。生根培养中，王利[23]在紫叶酢浆草组织培养中确定生根培养基激素配比为NAA 0.2 mg/L时，丛生芽发生效果好，叶片宽大，叶柄粗壮，根系健壮，培养全过程只要40 d，成活率最高达96%。而该试验培养基同时加入6-BA和NAA时，不论NAA为何种质量浓度钝叶酢浆草无菌苗的生长状况都不好。当培养基中只有NAA时，随着NAA质量浓度的升高，植株根系生长加快，NAA质量浓度为0.1 mg/L时，出根率59.2%，得到的无菌苗根密而粗壮，便于移栽。当NAA质量浓度超过临界值0.1 mg/L时，NAA质量浓度逐渐升高，钝叶酢浆草根系数量减少，植株长势变差，因此该试验将激素NAA确定为0.1 mg/L。

为了提高移栽成活率，让钝叶酢浆草组培苗更好生长，需要先在温室半阴处适应，同时因为钝叶酢浆草有遇高温休眠的习性，组培苗移栽后应尽量处于18～25 ℃的环境内，防止环境温度过高引起组培苗落叶休眠死亡。由于组培瓶内湿度大，移栽后的组培苗地上部分仍然要保持一定湿度，组培苗定植后的根系尚未完全适应基质，所以应保持基质湿润，防止基质过涝烂根。并随日常管理逐渐降低湿度，直至与温室内一致。此外需要注意的是，组培苗根部的培养基要清理干净，否则会滋生大量细菌真菌引起根部腐烂。

该试验以钝叶酢浆草叶片为外植体，检测叶片的消毒时间，筛选启动培养基、继代培养基和生根培养基，最终获得大量钝叶酢浆草组培苗，确立钝叶酢浆草组织培养技术体系，为批量化生产提供基础。