黑眶蟾蜍蝌蚪的适应性温度研究

徐大德 罗斯特 李彩欣

（1广州工商学院物流系，广东佛山528138；2肇庆学院生命科学学院，广东肇庆526062；3 厦门大学生命科学学院，福建厦门361102）

黑眶蟾蜍（Bufo melanostictusSchneider）隶属于两栖纲Amphibia，无尾目Anura，蟾蜍科Bufonidae，蟾蜍属Bufo［1］。主要分布在中国南部地区，包括云南、广西、广东、福建等地，在肇庆地区也属于常见种类，其繁殖期一般在3～6月,以捕食昆虫为主。黑眶蟾蜍能够大量捕食危害农林业的害虫，对促进农业和林业的可持续发展及维持生态平衡有着重大作用［2］；其耳后腺分泌物可制成中药“蟾酥”，被认为有解毒消肿止痛等功效，因此黑眶蟾蜍具有较高的经济价值。目前对于黑眶蟾蜍的研究报道主要有通过盐度、酸碱度、重金属、水等环境因子实验对其适应性影响，其中温度是调控生物形态发育、生理变化、行为适应和生存繁衍等重要的环境因子［3-7］。本实验以温度为调控因子，研究最适温度、逃避温度及致死温度对黑眶蟾蜍蝌蚪生长发育的影响，为黑眶蟾蜍的人工繁殖提供理论资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验以黑眶蟾蜍蝌蚪为实验材料，样品于2019 年4 月10 日采自肇庆学院生物园, 约20 日龄，体重0.064±0.013 g，体长1.126±0.035 cm。

1.2 实验方法

把采集到的蝌蚪各50 尾放入装有800 ml 原蝌蚪生活用水的3个1 000 ml的大烧杯里，放在温度分别为9℃、16℃和23℃的恒温培养箱中，驯化培养两周。驯化期间以蛋黄饲养，每两天换水一次，每次换去2/3，并捞出代谢废物及残渣。用温度梯度水槽装置进行记录蝌蚪的最适温度和逃避温度。温度梯度水槽装置由一个170 cm的玻璃水槽、冰水浴和温水浴组成（图1）。在玻璃水槽里注入约3 cm的自来水，水槽一端放置装有热水的陶瓷杯（温度为80℃），另一端放置冰袋，约2 h 内形成一系列的温度梯度。将同一驯化温度的蝌蚪，放入温度梯度水槽的中间位置（水温约24℃），30 min 后，用点温记（UT-325）测定蝌蚪所在位置的水温。以所有蝌蚪个体出现频率最高的位置或长时间停留的位置温度定为最适温度。将黑眶蟾蜍蝌蚪在水槽里游行时，掉转身体逃避时所在位置的温度定为逃避温度，同时将蝌蚪表现出乱撞、紧张、急躁等异常行为时所在位置的温度也定义为逃避温度。致死温度为采用恒温水浴锅逐渐升高温度直至蝌蚪死亡时的温度值。

图1 温度梯度模拟装置Fig.1 The simulation apparatus for temperature gradient

1.3 数据统计

对所有采集到的实验数据均使用Statistica进行统计,进行单因素方差(ANOVA)分析，将显著水平设在α＝0.05。

驯化反应速率(Acclimation response ratios,ARRs)以驯化反应总的温度变化除以忍耐温度变化量表示［8］。其计算方法如下：

最适温度的ARRs=(23-9)/(23℃驯化下的最适温度-9℃驯化下的最适温度)；

逃避温度的ARRs=(23-9)/(23℃驯化下的逃避温度-9℃驯化下的逃避温度)

2 实验结果

2.1 最适温度

实验结果显示受驯化温度影响，不同条件下的最适温度存在差异。在9℃条件下，黑眶蟾蜍蝌蚪的最适温度是17.3℃（15.2～21℃）；在16℃条件下，其最适温度是24.0℃（20～28.2℃）；在23℃条件下，其最适温度是25.6℃（22～29℃）。黑眶蟾蜍蝌蚪的最适温度范围、最适温度会随着驯化温度的升高而递增（图2）。统计结果表明黑眶蟾蜍蝌蚪的最适温度在不同的驯化温度下存在显著差性（F2,49=231.4，P＜0.05）。

图2 不同驯化温度下黑眶蟾蜍蝌蚪的最适温度Fig.2 The optimum temperature of Bufo melanostictus tadpoles at different temperatures

2.2 逃避温度

黑眶蟾蜍蝌蚪在9℃、16℃及23℃三个不同的温度驯化下的逃避温度影响也存在差异。在9℃、16℃和23℃驯化温度下，其逃避温度分别为26.4℃、31.3℃和33.5℃。单因素方差结果显示黑眶蟾蜍蝌蚪的逃避温度在这三个驯化温度下存在显著性差异（F2,49=141.87，P＜0.05）。本研究结果表明，可通过适当提高驯化温度来提高蝌蚪增强对温度变化的抗性，从而使其更好地适应高温环境影响。

2.3 致死温度

黑眶蟾蜍蝌蚪的高温致死温度范围是38～41℃，低温致死温度为2℃（表1、表2），统计结果显示，温度驯化差异对黑眶蟾蜍蝌蚪的致死温度无显著差影响（F2,49=2.03，P＞0.05）。

表1 黑眶蟾蜍蝌蚪的高温死亡率Table 1 The mortality of Bufo melanostictus tadpoles in high temperature treatment

表2 黑眶蟾蜍蝌蚪的低温死亡率Table 2 The mortality of Bufo melanostictus tadpoles in low temperature treatment

（四）驯化反应速率

本研究结果显示，驯化温度对黑眶蟾蜍蝌蚪最适温度的影响要强于对其逃避温度的影响（表3）。

表3 黑眶蟾蜍蝌蚪的驯化温度反应率（ARRs）Table 3 The acclimation response ratios of Bufo melanostictus tadpoles

3讨论

已有大量的研究表明在自然环境条件下，温度变化会显著影响两栖动物的生长发育。本实验中黑眶蟾蜍蝌蚪在不同温度驯化下，通过调节自身温度对环境改变做出适应性选择。黑眶蟾蜍蝌蚪的最适温度受到驯化温度的影响而变化，本实验中在9℃、16℃、23℃的驯化下，黑眶蟾蜍蝌蚪的最适温度分别为17.3℃、24℃和25.6℃。单因素方差分析(F2,49=231.4,P＜0.05)，说明驯化温度对黑眶蟾蜍蝌蚪的最适温度有着显著影响，在养殖生产过程中可以提高黑眶蟾蜍蝌蚪的驯化温度来提高其对高温的适应性［8］。

驯化温度对黑眶蟾蜍蝌蚪的逃避温度的影响差异性显著，随着驯化温度的提高，黑眶蟾蜍蝌蚪逃避温度在一定范围内提高，在9℃、16℃和23℃驯化下蝌蚪的逃避温度分别为26℃、31.3℃和35℃，该结果与中国林蛙蝌蚪（Rana chensinensis）和大蟾蜍蝌蚪（Bufo gargarizans）热忍受温度随着驯化温度提高而有提高报道相似［8］。这种现象同样存在于其他的外温动物的研究报道中［9］。

与前人对中国林蛙蝌蚪的热耐受性研究结果相比，可看到这两种蛙类的幼体在热耐受性上存在种间差异，这种差异可能代表了两种蛙类各自独特的生理特质，反映了不同地区的长期温度差异对其热耐受性的自然驯化［10］。具体表现为低温致死温度为2℃（黑眶蟾蜍）和0℃（中国林蛙）；高温致死温度是39℃（黑眶蟾蜍）和37～38℃（中国林蛙）。由此可见黑眶蟾蜍蝌蚪的低温耐受性要弱于中国林蛙蝌蚪，而高温耐受性要强于中国林蛙蝌蚪。本研究认为这种温度耐受性的差异原因可能是长期自然选择的结果：由于黑眶蟾蜍主要分布在华南地区，气候相对潮湿炎热，因而黑眶蟾蜍相对于中国林蛙蝌蚪的高温耐受性高［1］；而中国林蛙蝌蚪主要分布在中国的东北地区，冬季寒冷干燥，所以中国林蛙蝌蚪相对低温的适应性要强于黑眶蟾蜍蝌蚪［11］。因此通过对蛙类幼体进行热耐受性调节，能提高其对环境温度波动的适应性，具有非常重要的生态学意义［10］。

在驯化范围内（9～23℃），黑眶蟾蜍蝌蚪的驯化反应速率ARRs表现为最适温度大于逃避温度，该结果表明黑眶蟾蜍蝌蚪在一定驯化温度范围内，其最适温度的耐受性受驯化温度的影响程度比逃避温度耐受性受驯化温度影响程度大。本实验研究表明黑眶蟾蜍蝌蚪最适温度比逃避温度在环境温度变化上所产生的生理反应能力强。