结肠癌组织中MEG8、TGM2 mRNA的表达变化及其意义

谭智军，赵玉国，肖晓艳

郴州市第一人民医院，湖南郴州 423000

结肠癌属于消化道常见的恶性肿瘤，在我国的发病率和病死率逐年上升，是威胁人类生命健康的重要隐患[1]。结肠癌在起病初期并无特异性症状，确诊时癌症多已进展或转移，放化疗等治疗效果不佳，患者预后较差。长链非编码RNA(lncRNA)属于非编码RNA，其长度超过200 nt，在基因组印记、转录激活以及染色质沉默等过程中发挥重要作用;母源性表达基因8(MEG8)的本质是一种lncRNA，主要位于人14号染色体(14q32)的DLK1-DIO3印记区，对胚胎和脑组织的发育具有重要的调控作用[2]。研究[3]表明，肺癌细胞株中MEG8可通过转化生长因子-β抑制上皮间质转化过程(EMT)，从而抑制肿瘤的进展。转谷氨酰胺酶2(TGM2)是一种多功能的钙依赖性交联酶，通过使鸟嘌呤三核苷酸磷酸去磷酸化和鸟嘌呤二核苷酸磷酸磷酸化，介导信号通路转导，参与细胞生长和发育[4]。研究[5-6]表明，细胞外的TGM2通过结合钙离子激活自身转酰胺基酶活性，促进细胞外基质交联，有利于细胞黏附，从而促进肿瘤细胞进展。MEG8和TGM2在结肠癌中研究极少，二者是否具有相关性及与患者预后的关系尚不清楚。2014年1月—2015年4月，我们观察了结肠癌组织中MEG8、TGM2的表达变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取郴州市第一人民医院收治的结肠癌患者85例，男43例，女42例；年龄(58.21±8.47)岁，其中≥60岁者45例、<60岁者40例。纳入标准：①患者均符合《世界卫生组织肿瘤分类诊断系统》[7]中结肠癌的诊断标准且术后病理结果为结肠癌；②既往无肠道手术史或放化疗史；③所有患者的一般资料齐全，自愿协助本次研究，且按时接受随访。排除标准：①合并肠道淋巴瘤、肠结核或克罗恩病者；②合并其他原发恶性肿瘤者；③严重恶病质不能耐受手术者；④肝肾功能不良者；⑤先天免疫功能异常者。肿瘤≤3 cm者35例，肿瘤>3 cm者50例；淋巴结转移者10例，无淋巴结转移者75例；高分化者34例，中分化者43例，低分化者8例；TNM分期Ⅰ期33例，Ⅱ期40例，Ⅲ期7例，Ⅳ期5例。所有患者随访时间均为1～60个月，随访截止时间为2020年4月，随访过程中无失访病例。手术留取结肠癌组织及其癌旁正常组织各85例份。本研究经医院伦理委员会批准，且所有结肠癌患者均签署知情同意书。

1.2 结肠癌组织中MEG8、TGM2 mRNA检测方法 采用荧光实时定量PCR法检测。取结肠癌组织及其癌旁正常组织各30 mg，将1 mL的TRIzol试剂(Invitrogen公司)滴入研磨好的组织中，依照操作规程提取总RNA。将提取的10 μg总RNA，通过反转录试剂盒(TaKaRa公司)转化为cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(TaKaRa公司)定量检测MEG8和TGM2。MEG8和TGM2的反应条件均为37 ℃、30 min，85 ℃、15 s。PCR反应体系：2×SYBR Green Master为10 μL、正反引物均为1 μL、cDNA template 1.0 μL以及dH2O 7 μL，共计20 μL。MEG8正向引物序列：5′-ATCTCCAGCCTTGACTCTGACAC-3′，反向引物序列：5′-GAGGACGATGTACCAGGGTGCAGAGTG-3′；内参基因β-actin的正向引物序列：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，反向引物序列：5′-TAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3′；TGM2正向引物序列：5′-ACCGCTGAGGAGTACGTCTG-3′，反向引物序列：5′-CAGAGAAAGGCTCCAGGTTG-3′；内参基因GAPDH正向引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。MEG8和TGM2的PCR反应条件均为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，共计40个循环，每个样本设置3个复孔。由上海吉凯基因公司负责制备引物序列。通过相对Ct值法进行检测MEG8、TGM2 mRNA，结果以Ct值表示，相对于β-actin或GAPDH的比值为2-ΔΔCt，其中Ct=C目的基因-Ct内参基因。

2 结果

2.1 结肠癌及其癌旁正常组织MEG8、TGM2 mRNA相对表达量比较 结肠癌及其癌旁正常组织MEG8 mRNA相对表达量分别为0.62±0.23、1.87±0.55，TGM2 mRNA相对表达量分别为2.03±0.95、0.98±0.36，两者比较，P均<0.05。

2.2 MEG8、TGM2 mRNA表达与结肠癌临床病理参数的关系 结果见表1，由表1可知，MEG8、TGM2 mRNA表达均与结肠癌TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。

表1 MEG8、TGM2 mRNA相对表达量与结肠癌临床病理参数的关系

2.3 结肠癌组织MEG8 mRNA、TGM2 mRNA的表达相关性 Pearson线性相关分析结果表明，结肠癌组织中MEG8 mRNA和TGM2 mRNA表达呈显著负相关(r=-0.798，P<0.05)。

2.4 组织MEG8、TGM2 mRNA表达与结肠癌患者生存、预后的关系 以结肠癌组织中MEG8表达量的中位数0.63为临界值，其中高表达者45例，低表达者40例，高表达者5年总生存率为77.78%(35/45)、生存时间为(43.62±8.31)个月，低表达者分别为52.50%(21/40)、(31.07±7.25)个月，两者比较，P均<0.05。以结肠癌组织中TGM2表达量的中位数2.01为临界值，其中高表达者44例，低表达者41例，高表达者5年总生存率为54.55%(24/44)、生存时间为(37.21±9.68)个月，低表达者分别为78.49%(32/41)、(49.18±8.76)个月，两者比较，P均<0.05。结肠癌患者预后Cox回归模型分析结果见表2，由表2可知，高级别TNM分期、有淋巴结转移、MEG8 mRNA低表达、TGM2 mRNA高表达是影响结肠癌患者预后的独立危险因素(P均<0.05)。

表2 结肠癌患者预后Cox回归模型分析结果

3 讨论

结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率在恶性肿瘤中分别位居2、3位，且仍有继续上升的趋势[8]。结肠癌是多种因素共同作用的结果，其中以遗传基因、生活方式、地域差异、饮食结构为主。目前，手术切除肿瘤联合放化疗仍是临床中结肠癌最常用的治疗手段，然而由于结肠血供丰富、周围临近器官及淋巴结较多，使癌症易于累及周围器官并经血液或淋巴系统向远处转移，因此常规治疗效果较差，复发率较高，导致患者预后不良。表观遗传学是目前癌症领域的研究热点，对早期辅助诊断、评估病情以及预测患者预后具有重要作用。既往研究表明[9-10]，lncRNA、DNA甲基化、DNA拷贝数改变以及组蛋白修饰等过程不仅能够参与肿瘤细胞分裂分化，还可以调控肿瘤微环境，提高正常细胞癌变的风险。

lncRNA是结构高度保守的非编码RNA，能够参与核内运输、转录干扰以及转录激活等过程，对细胞定向分化、机体生长发育以及亚细胞结构分布等方面具有重要的调控作用。MEG8属于母源性等位基因，与MEG3共享DLK1-DIO3位点，主要包含微小RNA-341、微小RNA-1188及miR-370，能够调控胚胎发育和血管生成[3]。研究[11]表明，MEG8能够靶向作用其海绵基因，诱导过氧化物酶体增殖激活受体α蛋白表达，抑制血管平滑肌细胞增殖或迁移，能够有效调节血管动脉粥样硬化。在质粒转染试验中发现，MEG8能够明显降低δ样1同源物(DLK1)的转录水平，而DLK1在非小细胞肺癌中呈高表达，能够诱导血细胞异常增殖，起原癌基因的作用，因此，能够负向调控DLK1的MEG8具有抑癌基因的作用[12]。本研究显示，结肠癌组织中MEG8低表达，且与TNM分期及淋巴结转移有关，表明MEG8可能参与了结肠癌的发生。其原因可能为癌组织中的MEG8自身发生甲基化，导致转录后沉默，从而使自身表达量下调[3]。同时MEG8表达下调后能够激活Notch信号通路，诱导核内转录因子活化，促进表皮生长因子表达，从而加速癌细胞分裂及增殖[9]。此外，下调的MEG8对果蝇Zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)蛋白及上皮间质转化的抑制能力减弱，使癌细胞易于透过基底膜向周围组织器官侵犯，促进癌症迁移[13]。

TGM2属于转谷氨酰胺酶家族，通过结合多肽链合成不可逆的ε-赖氨酸，促进Ca离子依赖的翻译后蛋白修饰，从而调控细胞多种生命活动。TGM2能够稳定细胞外基质结构并重建细胞骨架，对维持细胞功能及增殖分化具有重要作用[14]。在胃癌组织中，TGM2通过介导细胞外调节激酶1/2信号通路诱导癌细胞分裂分化，并促进其转移[15]。研究[16]表明，TGM2能够诱导癌细胞向基质细胞转化，从而加速癌细胞侵袭，同时使癌细胞增强对化疗药物的耐药性。本研究显示，结肠癌组织中TGM2 mRNA表达升高，且与TNM分期及淋巴结转移亦有关，表明TGM2与结肠癌发生发展密切有关。文献报道，TGM2能够促进凋亡抑制蛋白(Bcl-2)并抑制凋亡促进蛋白(Bax)的表达，从而减少Bax同源二聚体生成，沉默细胞凋亡信号通路，促进癌细胞的增殖和分化[17-18]。此外，TGM2通过Wnt/β-catenin信号通路抑制E-钙黏蛋白表达，从而激活EMT过程，使癌细胞与周围正常细胞的极性消失，且分解细胞间连接，增强癌细胞向周围组织侵袭及迁移的能力[19-20]。

结肠癌组织中MEG8和TGM2 mRNA表达呈显著负相关，提示MEG8、TGM2 mRNA存在一定联系，二者相互作用影响结肠癌进展。MEG8和TGM2内在调控机制仍不清楚，但研究发现二者均能够参与EMT过程，影响EMT相关信号通路转导，从而影响肿瘤的进展[3，21]。Kaplan-Meier生存曲线结果表明，低表达的MEG8和高表达的TGM2 mRNA患者的预后情况明显更差，Cox回归分析进一步证实MEG8和TGM2 mRNA与结肠癌患者预后有关，因此临床可将MEG8和TGM2作为预后预测因子。

总之，结肠癌组织中MEG8呈低表达，而TGM2 mRNA呈高表达，且两者均与TNM分期及淋巴结转移有关，检测此指标对评估患者病情及预后具有重要价值。