禁抗前后规模鸡场环境中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对15种抗菌药的敏感性比较

王会生，张 佩，杜逢艳，赵四正，张 明，韩庆彦

（1.礼县畜牧兽医站，甘肃礼县 742200；2.商洛市疾病预防控制中心，陕西商洛 726000；3.甘肃省动物疫病预防控制中心，兰州 730046）

自农业部发布《遏制细菌耐药性国家行动计划（2016—2020 年）》以来，我国规模鸡场滥用抗菌药的情况得到了明显改善。2019 年7 月10 日，农业农村部发布第194 号令，全面禁止12 种抗菌药在饲料中的添加。2019 年1 月以来，甘肃省陇南市大部分规模鸡场开展了减抗乃至禁抗行动，滥用抗菌药情况得到有效控制。

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（以下简称“金葡菌”）是环境中最常见的细菌，也是最常见的条件性致病菌，其耐药情况较为严重。对山东省养殖场畜禽粪污样品检测发现，分离到的3 株金葡菌均对青霉素耐药，34 株大肠杆菌对氟苯尼考、利福平的耐药比高于50%[1]。赵丽青等[2]对青岛市城阳区动物源性食品中大肠杆菌和金葡菌进行了分离鉴定，并对13 种药物开展耐药性检测，发现多数菌株对多种药物出现不同程度的抗药，同一菌株对不同药物的耐药性也不同。

为了解甘肃省陇南市规模鸡场环境细菌禁抗前后对抗菌药的敏感性变化情况，指导规模鸡场临床用药，本研究拟分离、培养规模场鸡舍环境中的这两种细菌，并针对15 种常见抗菌药物开展药敏试验，以期为规模鸡场临床用药选择、细菌病防控和食品安全维护提供数据支持。

1 试验材料

1.1 培养基

牛肉膏、麦康凯琼脂，由北京奥博星生物制品公司生产；营养琼脂，由北京双旋微生物培养基制品厂生产。相关培养基均按常规制备，符合GB生化标准。

1.2 药敏纸片

土霉素药敏试纸，购自上海绿盟有限公司；青霉素、庆大霉素、红霉素、氟苯尼考、头孢唑啉、妥布霉素、头孢拉定、恩诺沙星、头孢曲松、卡拉霉素、氨苄西林、头孢氨苄、磺胺异噁唑、林可霉素等14 种药敏试纸，均购自杭州生物制剂有限公司。上述15 种药敏试纸均执行标准WS/T125—1999，每个药敏试纸的药物含量均为30 μg/片。

2 试验方法

2.1 样品采集

随机选择甘肃省陇南市2 个乡镇5 个存栏1万只以上的规模鸡场（A 镇的场1～3，B 镇的场4～5），具体情况见表1。在禁抗实施前以及禁抗实施6 个月后采样，采样时尽量选择禁抗时间相同的养殖场，如不同则选择禁抗前后间隔时间差距在6 个月以内的养殖场。采样前用灭菌生理盐水将灭菌棉签浸湿，在采样点充分擦拭。每个养殖场在墙壁、饲槽、水槽处各采集3 份样品（共9 份），每次共采集45 份，两次共采集90 份样品。样品在采集后2 h 内检测。

表1 规模鸡场有关情况

2.2 细菌培养

将采集样品分别接种肉汤培养基，37 ℃培养24 h，然后用接种环分别划线接种麦康凯琼脂和普通营养琼脂培养基，37 ℃培养24 h；若菌落在普通琼脂上生长不好，可以延长培养6～12 h。

2.3 细菌鉴定

2.3.1 大肠杆菌 在麦康凯培养基上挑选粉红色、光滑、边缘整齐的单个菌落，镜检为革兰氏阴性杆菌后，挑选相同菌落接种葡萄糖发酵管进行糖发酵实验，37 ℃培养48 h，观察是否产生轻微气体、变黄；刺种三糖铁培养，37 ℃培养24 h，观看底部是否变黄并有黑色沉淀；接种蛋白胨水，37 ℃培养48 h，再加入吲哚试剂，出现红色。以上3 种生化试验均为阳性可鉴定为大肠杆菌[3-4]。

2.3.2 金葡菌 在普通琼脂上挑选露滴状、边缘整齐的金黄色单个菌落，采用革兰氏染色镜检，若观察到革兰氏阳性呈葡萄串样者，可鉴定为金葡菌[5]。

2.4 药敏试验及结果判定

按照陈学灿等[3]方法并结合全国细菌耐药性检测标准，将培养的细菌密涂于平板培养基上，再用无菌眼科镊将不含抗菌药的滤纸片平贴于平皿中央，再将各种含不同抗菌药的纸片平贴于周围，盖上皿盖后标明日期，置37 ℃培养24 h 后，取游标卡尺读取各种抗菌药的抑菌数值。

抗菌药敏试验的判定标准为，结合实际情况，以抑菌环的直径来判断药物的敏感性，即以抑菌环直径（指药敏试纸边缘的抑菌环直径大小）≥4.5 mm为高度敏感（S），介于1～4.5 mm 为中等敏感（I），≤1 mm 为耐药（R）[3，6]。

2.5 敏感性比较

计算禁抗前后大肠杆菌和金葡菌对15 种抗菌药的敏感性差值，得出两种细菌对15 种抗菌药的敏感性变化情况，并予以比较。

3 结果

3.1 大肠杆菌和金葡菌检出情况

在禁抗前，5 个规模场45 份环境样品中均检出大肠杆菌，占比达到100%；37 份样品检出金葡菌，占比82.2%。禁抗6 个月后，45 份样品中依旧均检出大肠杆菌，占比100%；39 份样品检出金葡菌，占比86.7%，占比略有上升。

3.2 药敏试验

对禁抗前后检出的大肠杆菌和金葡菌开展15种抗菌药的药敏试验。结果（表2）显示，禁抗前后各规模鸡场的大肠杆菌和金葡菌的抗菌药耐受性各有不同，但总的来说禁抗后这两种细菌对15 种抗菌药的敏感性都有不同程度的提高。

具体来看，大肠杆菌禁抗前对妥布霉素、林可霉素、头孢拉定、卡拉霉素等抗菌药敏感，禁抗后对这几种抗菌药更加敏感；禁抗前对磺胺异噁唑、土霉素和头孢唑林、青霉素等抗菌药不敏感，禁抗后虽然敏感性有所提高，但提高幅度有限。金葡菌禁抗前对头孢曲松、卡拉霉素、头孢唑啉、氟苯尼考等敏感性强，在禁抗后对这几种抗菌药更加敏感；禁抗前对土霉素、磺胺异噁唑、庆大霉素、妥布霉素等敏感性差，禁抗后敏感性有所提高，但提高幅度同样有限。

3.3 敏感性比较

通过计算禁抗前后大肠杆菌和金葡菌对15 种抗菌药的敏感性差值，比较敏感性变化情况。结果（表3）显示，总体上两种细菌对大部分抗菌药的敏感性有不同程度的增加（差值为正），但也存在对个别抗菌药敏感性下降的情况（差值为负）。具体而言，大肠杆菌在禁抗6 个月后对抗菌药的敏感性增幅较大，平均为8.59%。其中对卡拉霉素、头孢拉定、庆大霉素的敏感性均增加了20%左右，而对土霉素、磺胺异噁唑等的敏感性增幅较少；对氟苯尼考的敏感性不增反降。金葡菌对15 种抗菌药的敏感性增幅较大肠杆菌小，平均为5.95%。只有对红霉素的敏感性增加了19.0%，其余均在10%以下，而对青霉素的敏感性不升反降。

使用SPSS 20.0 统计软件，采用非正态分布定量资料的配对的秩和检验，在检验水准为ɑ=0.05的水平下，Z=5.918，P＜0.05，认为两种细菌对抗菌药的敏感性有显著差别，其中大肠杆菌对抗菌药的敏感性要强于金葡菌（图1）。

表3 禁抗前后大肠杆菌和金葡菌对15 种抗菌药的敏感性变化情况 %

表2 两种细菌禁抗前后的药敏试验结果

图1 曼-惠特尼检验结果

4 讨论

禁抗前，陇南市本地规模鸡场多采取7 日龄前后在饮水中添加10%阿莫西林可溶性粉，15～19日龄在饲料中添加10%多西环素，鸡成年后在饲料中添加替米考星、土霉素或泰乐菌素等，养殖过程中，还会在饲料添加四环素、新霉素等用于预防疫病；此外，鸡场常使用氟苯尼考类、地米考星、泰乐菌素、红霉素等治疗呼吸道疾病，使用大观霉素、硫酸链霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、磺胺类药物等治疗消化道疾病，使用青霉素、头孢拉定、林可霉素、妥布霉素等治疗感冒；在其他疾病治疗中比较常见的还有强力霉素、氨苄西林、泰万菌素、卡拉霉素、阿奇霉素、莫能菌素，头孢氨苄、替米考星、两性霉素B 等。基于上述情况，本研究选择常见的15 种抗菌药开展药敏试验，以探究禁抗前后鸡场环境中两种细菌对抗菌药的敏感性变化情况。

试验发现，不同抗菌药禁抗前后对于大肠杆菌和金葡菌的抑菌效果不同。全面禁抗6 个月后，大肠杆菌和金葡菌对大部分抗菌药的敏感性有不同程度的提高。平均来看，大肠杆菌对15 种抗菌药的敏感性提高了8.59%，金葡菌提高了5.95%，说明随着抗菌药的禁用，鸡场环境中大肠杆菌与金葡菌的耐药性有所减弱，其对抗菌药的敏感性逐步恢复。但是，大肠杆菌对氟苯尼考以及金葡菌对青霉素的敏感性不升反降，推测可能因禁抗前相应药物使用过多，导致鸡场环境中的耐药菌株在短期内无法彻底消除[7-10]，还需延长禁抗时间，进一步观察禁抗效果。此外，对于不同养殖方式（肉鸡或蛋鸡）、不同养殖年限的养殖场，禁抗前其抗菌药添加的方式、剂量、种类等也不尽相同，因此还有待于深入研究，以便为规模鸡场科学使用抗菌药提供理论依据。养殖场也应加强中草药等方剂的利用，探索使用微生态制剂、酸制剂、植物精油等，结合生物安全等方面做好禁抗后禽病防治问题，这也是未来绿色健康养禽业的必由之路。