参苓白术颗粒对脓毒症大鼠的保护作用及对肺水代谢的影响*

巫莉萍 薛小燕 温建东

脓毒症是感染、创伤等诱发剧烈全身性炎症反应，引起组织器官继发性损伤的临床症候群，脓毒症休克是重症监护患者最常见的死亡原因，死亡率高达20%～80%[1]。肺是脓毒症最易受影响的靶器官，肺损伤往往最早出现，一旦出现肺损伤往往预示预后不佳[2]。急性肺损伤是各种直接或间接因素引起肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿、急性低氧性呼吸功能不全等[3]。临床证实，肺水清除率高的脓毒症患者，需要呼吸机支持治疗的时间相对缩短，病死率降低[4]。本研究主要探讨具有补益脾肺之气和利水渗湿作用的参苓白术颗粒对脓毒症大鼠的保护作用以及对肺水代谢的影响，证实免疫增强对脓毒症治疗有效，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 脓毒症大鼠模型 该研究起止时间为2017 年1 月-2019 年4 月，选择6～8 周龄健康雄性SD 大鼠40 只，体质量200～230 g，由赣南医学院实验动物中心提供，经普通饲料适应性喂养1 周后备用。将40 只大鼠随机分为对照组、模型组、参苓白术预防组和治疗组，每组10 只，参苓白术颗粒购自云南腾冲制药厂。

1.2 方法 对照组手术切开后在缝合，模型组构建脓毒症模型，预防组在造模前即应用参苓白术灌胃处理，治疗组在造模后才应用参苓白术灌胃处理。采用盲肠结扎穿刺法（CLP）复制脓毒症模型：术前禁食12 h，乌拉坦（1 250 mg/kg）腹腔注射麻醉，将大鼠仰面固定，中下腹取4 cm×4 cm 面积备皮，常规消毒，沿腹正中线做3 cm 长切口，沿腹白线分离肌层切开腹膜进入腹腔，游离肠系膜和盲肠，以手术丝线环形结扎盲肠根部，用21 号针头在结扎端贯通穿刺1 次，挤出粪便少许，还纳肠段，依次缝合腹膜和皮肤，消毒手术创面。

1.3 观察指标和检测方法

1.3.1 肺组织病理观察 （1）大体观察：麻醉后剪开胸腔完整取出双侧肺叶，滤纸吸干表面血迹，肉眼观察肺脏的形态变化。（2）病理学HE 染色及评分：取左肺放于4%多聚甲醛中固定24 h，经乙醇梯度脱水、二甲苯浸透、石蜡包埋、5 μm 厚切片、二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水、HE 常规染色、封片后光镜观察肺组织病理变化。每一标本由同一位病理医生根据肺间质水肿、肺泡水肿、炎细胞浸润、肺泡出血、透明膜形成和肺不张改变共6 个项目，按无、轻、中、重分别计0、1、2 和3 分，各项相加总分0～18 分，分值越高，肺损伤越重。（3）肺湿重/干重比值（W/D）测定：开胸后取右肺上叶，生理盐水漂洗，滤纸吸干表面液体称湿重，经70 ℃烘箱烘烤48 h 后称干重，计算W/D，剩余标本置-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 肺组织AQP-1 mRNA 含量检测 采用实时荧光定量聚合酶链（qRT-PCR）法检测，结扎右主支气管，剪右中肺组织，立即置于液氮罐中-180 ℃保存，组织研磨后用Trizol 抽提组织总RNA，经紫外分光光度计、琼脂糖电泳检测RNA 纯度和完整性。按照逆转录试剂盒（takara，Code NO.RR036A）说明书合成cDNA。参照SYBRPremix Ex TaqTM 试剂盒说明书建立20 μL 反应体系，其中2μL cDNA为模板扩增，肌动蛋白β-actin 为内参照，利用PCR 仪扩增。反应条件为：95 ℃ 30 s 变性，95 ℃5 s，60 ℃ 31 s，40 个循环。样品管和内参管均设3 个复管，反应结束后，ABI7300 SDS Software 自动分析荧光信号转换CT 值，CT 值取3 个复管的平均值。△CT 为目的基因CT 值与内参CT 值的差值，以2-△△CT法计算目的基因与内参基因荧光的比值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，多组间比较采用方差齐性分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD 法）；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理比较 与对照组比较，模型组大鼠肺组织大体观察水肿和出血严重，半定量评分升高，W/D 值增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，预防组和治疗组评分降低，W/D 值下降，并且预防组比治疗组评分降低，W/D 值下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肺组织病理比较（±s）

表1 各组大鼠肺组织病理比较（±s）

*与对照组比较，P＜0.05；#与模型组比较，P＜0.05；△与治疗组比较，P＜0.05。

2.2 各组大鼠肺组织AQP-1 mRNA 表达比较 对照组、模型组、预防组和治疗组AQP-1 mRNA 表达分别为（0.36±0.09）、（0.75±0.19）、（0.42±0.11）、（0.56±0.14），与对照组比较，模型组大鼠肺组织AQP-1 mRNA 表达增加（t=32.236，P＜0.001）；与模型组比较，预防组和治疗组AQP-1 mRNA 表达均减少（t=-26.532、-15.234，P＜0.001）；并且预防组比治疗组AQP-1 mRNA 表达减少，差异有统计学意义（t=-13.236，P＜0.001）。见图1。

图1 qRT-PCR法检测肺组织AQP-1 mRNA表达

3 讨论

大量研究证明，单一对脓毒症进行抗炎而忽视免疫系统的调节是不够的[5]。与非脓毒症死亡患者相比，脓毒症死亡患者存在明显的免疫抑制表现，免疫强化治疗可改善临床疗效[6]。脓毒症的病程进展迅速，早期非常短，一般不易发现，入院时多处于中晚期，此时机体经历脏气受损、正邪相争的阶段，很快进入脏气衰败阶段。这一转变过程相当于西医提出的脓毒症诱因到脓毒症、全身炎症反应综合征（SIRS）到多器官功能障碍综合征（MODS）[7]。几乎所有脓毒症患者均可见正气不足之征，疾病越重气虚越明显，甚至形成阳气亏损、阴竭阳脱等危急症候。

从《内经》阴阳的关系来看，严重脓毒症开始以应激反应和炎症反应作为机体的保护机制，类似中医所说的正气奋起抗邪，属于实证。但应激反应和炎症反应过度则引起机体应激和免疫失衡，类似中医的阳胜则阴衰，从而出现急性阴阳失衡的状态，严重脓毒症在进展过程中常出现免疫麻痹，类似中医正气无力抗邪的急性虚证，表现“邪毒炽盛，正气已虚”之本虚标实的病机特点[8]。所以，中医认为脓毒症发病多由邪毒入侵（严重感染）损伤正气，故正虚邪盛贯穿于脓毒症发病的全过程[9]。

现代医学在邪盛方面的治疗具有明显优势，例如广谱抗菌药物、外科手术、呼吸机、床边连续性肾脏替代治疗（CRRT）等，是中医始终难以超越的[10]。现代医学在增强机体自身抵抗力方面非常有限，效果欠佳；而中医在扶正方面可谓得心应手，在正虚方面大有作为。扶正包括阳（气）、阴（血）两个方面，中医认为“有形之血不可速生，无形之气所当速固”。现代医学通过大量补液、输血、输人蛋白而使血（阴）受损迅速得到纠正，但气（阳）受损难以用现代手段短时间内恢复[11]。中医《内经》认为正气内虚是所有疾病的根本原因，也是脓毒症发病的根本原因[12]。《内经》云：“阴平阳秘，精神乃治，阴阳离决，精气乃绝。”说明机体正气充足，阴阳调和，则疾病痊愈，可恢复健康；若阴阳受损进而离绝，则生命消逝。所以扶助阳气就成为中医治疗脓毒症的重点，也是中西医结合治疗脓毒症的切入点[13]。

既往中医治疗脓毒症多从毒瘀入手，近年来，扶正逐渐成为脓毒症治疗的热点。益气扶正，可以补气通阳，使阳气畅达，通过整体调节，发挥机体本身的抗病能力，促进内环境的稳定，达到“各安其气，必清必静，则病气衰去，归其所宗”[14]。因此，中医强调补气在脓毒症治疗中的重要作用是基于中西医结合取两者之长，在现代西医急救手段的配合下，发挥中医的优点，整体调节，提高机体本身的抗病能力，促进内环境稳定，争取达到最佳疗效，提高治愈率，降低病死率[15]。

通过该研究发现，与对照组比较，模型组大鼠肺组织大体观察水肿和出血严重，半定量评分升高，W/D 值增加，AQP-1 mRNA 表达增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，预防组和治疗组评分降低，W/D 值下降，AQP-1 mRNA 表达减少，并且预防组比治疗组评分降低，W/D 值下降，AQP-1 mRNA 表达减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。参苓白术散药性味平和，由人参、茯苓、白术、山药、白扁豆、莲子、薏苡仁、砂仁、桔梗、炙甘草组成，具有健脾益气，利水渗湿之功效[16]。研究发现，对非酒精性脂肪性肝病的防治疗效显著；对免疫功能的调节作用，如脾虚泄泻小鼠模型和环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制动物模型，能显著增强其免疫功能；增加或减少肠道细菌数量，恢复肠道菌群平衡，保护肠道黏膜组织，双向改善胃肠动力，治疗胃动力不足或腹泻[17-18]。中医理论认为，肺主通调水道，属“金”，脾主运化水湿，属“土”，脾肺互为母子关系，通过培土生金既可补益脾肺之气达到免疫强化之功，又能促进水液的正常代谢。参苓白术颗粒具有健脾益气之效、桔梗可引药上行，取培土生金之意增强免疫力；茯苓、薏苡仁、砂仁兼有化湿利水之效，可促进肺水代谢[19]。

综上所述，参苓白术颗粒能够降低脓毒症肺损伤严重程度，抑制肺组织AQP-1 表达，改善肺水代谢，并且预防性应用较治疗效果更突出。该研究创新之处为目前还未见有参苓白术颗粒在脓毒症中的应用报道，更未见从肺水代谢方面研究其保护机制，通过该研究既能证实“免疫强化对脓毒血症有效”这一理论，为拓展脓毒症的药物治疗提供实验依据，为患者带来更佳的治疗效果，又能进一步阐明参苓白术颗粒对脓毒症的保护机制是否与影响肺水代谢有关。