逍遥丸对产前应激子代大鼠学习认知的影响机制*

刘雁 张锦 赵晨翔 王坤峰 赵天辰 侯祥林 季粟英

产前应激（prenatal stress，PS）是指孕期妇女受到内外环境变化及精神心理因素等刺激产生的全身、非特异性的应激反应。多项研究表明，在怀孕期间，如果母亲出现应激等不良的情绪变化，导致子代更容易出现情感、行为和认知等方面能力的下降[1-2]。2001 年有研究指出在孕期这一特殊敏感时期，宫内环境的改变会影响胎儿的发育，如会导致胎儿颅骨畸形，心肌结构受损等，并且会对胎儿的生理系统产生长远影响[3-4]。Carmichael 等[5]报道产前社会心理性应激因素可增强先天畸形儿的发病率，如患神经管畸形率增加接近2 倍。流行病学调查也显示产前应激可明显影响新生儿出生时的头围和体重，尤其以头围减小最为明显，证实了PS 可对胎儿的脑发育产生特异性影响[6]。伴随PS 对子代影响的深入研究，发现PS 不仅影响胎儿的身体发育情况，如头围、体重、各器官的畸形等，而且会影响子代的学习认知能力和情绪障碍[7]。产前应激导致子代认知功能障碍的研究，一般认为与海马突触可塑性与长时程增强（long-term potentiation，LTP）和长时程压抑（long-term depression，LTD）有关[8]。而谷氨酸受体中的AMPARs 在调节海马突触可塑性方面发挥着关键作用[9-10]。

AMPARs 由四个亚基构成，广泛分布于中枢神经系统，如海马体、脑皮层，杏仁核和丘脑[11]。AMPARs 主要与离子通道偶联，形成受体通道复合物，介导快信号传递。前期大量研究已经证实海马体CA1 区的AMPARs 诱导了LTP 和LTD 的产生[12-15]。AMPARs 调节LTP 和LTD 的作用尤其在生物发育早期发挥关键作用。Bradley 等[16]研究发现空间学习能力的小鼠海马体中的AMPA 受体数量与正常相比明显减少，Penn 等[17]也发现AMPA 受体在压力诱导的受损的空间学习和记忆等方面发挥着关键作用。

逍遥丸出自宋代《太平惠民和剂局方》，因其具有疏肝解郁、健脾养血的功效，以前常作为中医调理情志病的药方，并有研究发现逍遥丸具有抗抑郁的作用[18]。然而，逍遥丸是否具有改善认知的作用，目前还没有报道，本文将就此开展研究，探讨逍遥丸是否可以改善PS 子代的学习记忆能力以及具体影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验于2018 年9 月-2019 年11 月进行，所有40 只SD 大鼠购自济南金丰实验动物有限公司，许可证号：SCXK（鲁）2018-0006。均饲养在温度24 ℃、湿度60%、12 h∶12 h（8：00-20：00）光-暗循环的动物房中，自由饮水饮食。饲养一周适应环境后，将雌性大鼠（230～250 g）和雄性大鼠（280～350 g），按照3∶1 比例于20∶30进行合笼，次日8：30 前对雌性大鼠阴道进行涂片检查。若精子阳性定为妊娠第0 天，然后将受孕大鼠单笼饲养，

1.2 实验方法

1.2.1 造模 按照文献[19-20]方法将孕鼠置于一个透明两端均有通风口的塑料圆柱形装置里，内部直径约6 cm。其一端通风口底部固定，另一端则根据孕鼠体长适当调整长度。束缚应激3 次/d 进行，即在其孕14～20 d 的8：00-11：00、12：00-15：00、16：00-19：00 三个时间段各进行1 次，45 min/次。为防止应激大鼠产生习惯性，每次应激的间隔时间均不少于2 h。在子鼠出生21 d 断奶后，每窝随机拿出子代大鼠1～2 只进行后续实验。所有子鼠均单笼饲养在温度24 ℃、湿度60%、12 h∶12 h（8：00-20：00）光-暗循环的动物房中。

1.2.2 给药及分组 出生后第21 天子代大鼠，未进行产前应激为正常组（CON）；产前应激子代逍遥丸（生产厂家：仲景宛西制药股份有限公司，批注文号：国药准字Z41021831，规格：每8 丸相当于原药材3 g），200 mg/kg 溶于0.9%氯化钠溶液及相应0.9%氯化钠溶液灌胃，作为PS+Xiaoyao Pill 组和PS+NS 组。逍遥丸溶液灌胃10 mL/kg，连续进行30 d，PS+NS 组灌胃对等的0.9%氯化钠溶液。未行灌胃的产前应激子代为PS 组。每组均为10 只。

1.2.3 Morris 水迷宫实验 受试子代大鼠训练前1 d 首先放到水迷宫（直径180 cm，水温22 ℃）中适应1 min。训练时间6～7 d，2 次/d。训练过程中，大鼠进入水迷宫游泳5 min，到达平台后（平台在水面下1.5 cm），记忆巩固30 s。训练结束后，撤去平台，记录大鼠首次到达平台的时间，以及运行轨迹和运动速度。数据由SMART 3.0（Panlab，Spain）软件进行记录。

1.2.4 West blot 实验 行为学完成后，麻醉后冰上快速分离出海马组织。称重后放入预冷的RIPA裂解液（Solarbio，China，使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF，使PMSF 最终浓度为1 mM）制备蛋白样品。4 ℃，12 000 r/min 离心5 min 后收集上清。使用ND-1000 分光光度计测定蛋白浓度。每组蛋白样品以10% SDS-PAGE 进行电泳分离，继之电转至0.45 μmPVDF 膜上（Millipore，U.S.A）。5%脱脂奶粉的PBST 室温封闭2 h，加入一抗：GluA1（1∶3 300，ab31232，Abcam，U.S.A），4 ℃过 夜。次日PBST 洗膜3×10 min，然后PBST 稀释的二抗（1∶8 000，Pioneer，China）室温孵育1 h 后，PBST再洗3 次，15 min/次。ECL 化学发光（Millipore，China）后使用凝胶成像系统（Bio-Bad，U.S.A）拍照，Quantity One 软件扫描目的蛋白条带灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t 检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 逍遥丸对PS 子代大鼠学习认知的影响 PS组到达平台所用时间为（33.91±16.34）s 明显长于CON 组的（7.28±2.67）s，差异有统计学意义（P＜0.05）；而PS+Xiaoyao Pill 组到达平台时间为（9.94±1.86）s 明显短于PS+NS 组的（35.67±17.3）s，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A、B。四组的运动距离表现出相同的变化，见图1A、C。四组游泳速度分别为CON 组（41.98±1.06）cm/s，PS 组（41.97±0.67）cm/s，PS+NS 组（41.93±1.16）cm/s，PS+Xiaoyao Pill 组（47.38±10.85）cm/s，四组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图1A、D。

2.2 逍遥丸对PS 子代大鼠海马体GluA1 蛋白表达的影响 PS 组GluA1 蛋白的相对表达量为（0.76±0.17） 低 于CON 组 的（1.15±0.15），PS+Xiaoyao Pill 组的GluA1 蛋白相对表达量为（1.12±0.13）高于PS+NS 组的（0.70±0.16），差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2。

3 讨论

大量研究表明母体产前的一些不良应激，可影响子代的生长发育的进程以及出现不良的神经发育障碍，并且哺乳动物神经发育尤其是海马组织大都相对集中于某一特定时间段。例如孕7～14 周是人类海马组织发育的主要时间段，而大鼠海马组织的发育主要集中在孕晚期，并且孕晚期还是中枢髓鞘发育加速、胶质细胞形成以及突触形成活跃的时期[21]。因此孕晚期的应激较易导致海马组织相关功能失调，从而引起学习记忆能力下降和抑郁焦虑等情绪障碍。这也是本研究之所以在孕晚期进行产前束缚应激干预的重要依据之一。

图2 逍遥丸对子代大鼠海马体GluA1蛋白表达的影响

水迷宫实验是经典检测学习认知等功能的实验之一。本研究结果发现，PS 子代大鼠首次到达平台时间明显长于CON 组（P＜0.05），初步表明PS 可能会影响子代的学习认知功能。而经过逍遥丸干预后，PS+Xiaoyao Pill 组时间显著缩短，基本恢复到正常组水平，提示逍遥丸具有改善PS 造成子代大鼠认知功能受损的作用。并且发现四组大鼠游动距离和其到达平台时间相对应，四组游泳时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明PS 只是影响子代大鼠的认知功能，对其运动功能没有明显影响。

PS 导致子代大鼠认知障碍的机制之前也有相关研究，但是AMPA 受体是否参与其中未见报道。为证实AMPA 受体是否参与PS 造成子代认知障碍的过程，本研究又采用Western blot 实验观察AMPA受体蛋白的表达，结果发现，PS 可导致子代大鼠海马体中的GluA1 受体表达降低。由于AMPA 受体是中枢重要的一种离子型受体，在介导突触传递，突触可塑性的形成和维持以及神经发育、学习记忆、感知等方面发挥重要作用，AMPARs 又是通过何种机制参与其中。本研究认为与其在神经突触中的功能密切相关，海马突触可塑性的调节已经证实依赖于AMPARs 功能的正常。AMPARs 如果发生改变，将明显影响海马突触可塑性。多项研究暗示突触的AMPARs 不仅在数目上，而且在分子组成上的变化都将导致突触可塑性变化[22-24]。突触可塑性是学习和记忆的细胞学基础，突触可塑性的紊乱也是多种精神疾病发生的原因之一[25]。因此由结果提示，PS导致子代大鼠认知障碍的机制之一是抑制了海马体中GluA1 蛋白受体的表达，从而导致突触可塑性改变所致。而给以逍遥丸干预后，结果发现，可明显提高PS 子代大鼠海马体中GluA1 蛋白受体的表达。由此推测，逍遥丸之所以可以改善PS 大鼠的认知功能受损，可能与其可提高GluA1 表达，从而改善突触可塑性有关。

逍遥丸作为一种传统经典中成药，以前作用普遍认为具有疏肝解郁，通过补肝体、助肝用、理气养血、调和肝脾而起到改善肝气不舒，胸胁胀痛，头晕目眩，食欲减退，月经不调等作用[26]。近来也有研究发现逍遥丸还有改善抑郁等情志疾病的作用[27]。

综上所述，本研究进一步发现逍遥丸其可通过提高海马体GluA1 的表达具有改善PS 子代大鼠学习认知障碍的作用。以往研究发现PS 不仅可造成子代出现学习认知功能障碍，而且还可导致抑郁焦虑等精神功能受损。新发现的逍遥丸抗抑郁及改善认知功能的作用，可能为以后改善应激所导致的神经中枢功能受损提供新的治疗方案。