新型冠状病毒核酸检测试剂盒的性能验证

王亚飞，宋凌燕，冯都都，马良，王晋霞，陈莎丽，史盟浩，李豪哲，曹慧媛，匡雪莉，纪爱芳

(长治医学院附属和平医院检验科，山西 长治 046000)

0 引言

新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的肺炎从2019年底开始广泛传播，并在全球蔓延，形势十分严峻。COVID19已经成为世界卫生公共安全所要面对的问题。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，新型冠状病毒肺炎确诊病例的诊断标准为有流行病学史和临床表现的疑似病例同时具备病原学或血清学证据之一者。常用的病原学证据即为实时荧光RT-PCR检测2019-nCoV核酸阳性[1]。为确保本室新型冠状病毒核酸检测结果质量的可靠，根据《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》(CNAS-CL02-A009)和《分子诊断检验程序性能验证指南》(CNAS-GL039)，对上海伯杰医疗科技有限公司生产的2019-nCoV核酸检测试剂盒在Lepgen-96全自动医用PCR仪上的性能验证，内容包括方法符合率、检出限、精密度、交叉反应等[2-3]。

1 材料与方法

1.1 样本来源

健康体检者咽拭子2019-nCoV核酸检测阴性样本。2019-nCoV RNA液体性能验证参考品(广州邦德盛公司)，浓度为2.0×106copies/mL和2.0×105copies/mL的2019-nCoV RNA假病毒核酸标准物质编号分别为GBW(E) 091133和GBW(E) 091132。阴性对照及阳性对照为试剂盒配套。

1.2 试剂和仪器

核酸提取试剂和EX3600全自动核酸提取仪(上海之江生物科技股份有限公司)、新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂(上海伯杰医疗科技有限公司)、Lepgen-96全自动医用PCR仪(山东鑫贝西科学仪器有限公司)。

1.3 方法

按核酸提取试剂盒说明书进行核酸提取，实时荧光RTPCR测定按核酸检测试剂说明书操作，用ORF1ab基因和N基因作为检测靶基因。扩增条件：50℃，15min；95℃，15min；94℃，15s，55℃，45s，40个循环。使用配套软件(Real-Time PCR软件v2.4)进行数据分析。根据扩增曲线，调整基线和荧光阈值，得到不同通道循环阈值(cycle threshold，Ct)。阳性标准为FAM和VIC通道有明显扩增曲线，且Ct≤40；阴性标准为FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值＞40，且Cy5通道有扩增曲线；如仅在FAM或VIC单一通道Ct值≤40，另一条通道无扩增曲线，则结果需复检，复检结果一致可判为阳性，复检均为阴性则判为阴性。

1.4 性能验证方法

1.4.1 符合率

选用相同检测方法的通过ISO15189认可和卫生健康委员会组织的2019-nCoV核酸检测室间质评的实验室作为参比实验室。选取阴阳性样本各6例，其中阴性样本为健康体检2019-nCoV核酸为阴性的样本、阳性样本3例使用上海伯杰医疗科技有限公司生产的新型冠状病毒SARS-CoV2企业参考品2(浓度为5×103copies/mL，货号：ZC-HX-201CKP2)进行原倍、2倍、20倍稀释，2例使用检测试剂盒自带阳性对照品(浓度为1×105copies/mL)进行原倍、100倍稀释。1例使用广州邦德盛生物科技有限公司生产的室内质控品S1(浓度为2.19×103批号为2020013)。按照患者样本检测程序与参比实验室进行比对，以参比实验室结果为准，计算本实验室与参比实验室的总符合率、阳性符合率和阴性符合率。

1.4.2 检出限

根据试剂说明书声明的检出限为500copies/mL，使用上海伯杰医疗科技有限公司生产的新型冠状病毒SARSCoV2企业参考品2(浓度为5×103copies/mL，货号：ZC-HX-201CKP2)进行10倍稀释后重复测定5次，100%检出靶核酸，则检出限验证合格。

1.4.3 交叉反应

本实验使用的分析特异性参考品为广州中山达安公司生产的标准物质。取一定浓度与待测核酸可能存在交叉反应的病原体加入经确认为阴性的样本中，与常规标本一样处理，至少重复检测3次。判断标准为结果应为阴性。

1.4.4 精密度

检测浓度为5.0×103copies/mL和5.0×105copies/mL的参考品，同一份样本重复测定10次，计算各靶基因Ct值的变异系数，评价批内不精密度。每份样本重复测定2次，连续测定5天，计算各靶基因Ct值的变异系数，评价批间不精密度。判断标准为符合说明书声明范围批内、批间CV均不大于5.0%则验证合格。

2 结果

2.1 符合率

本试剂检测结果与参比实验室检测结果进行比对，发现6例阳性标本ORF1ab基因和N基因Ct值均＜40，6例阴性标本均没有Ct值，总符合率、阳性符合率和阴性符合率均为100%，符合率验证合格。

2.2 检出限

在检测下限验证中，本试剂盒对浓度为5.0×102copies/mL的2019-nCoV RNA阳性样本ORF1ab基因和N基因Ct值均＜40，检出率为100%。结果符合试剂说明书声明标准，检出限验证合格。

2.3 交叉反应

交叉反应验证中检测含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、人巨细胞病毒、EB病毒、肺炎支原体、结核分枝杆菌样本的2019-nCoV阴性样本，重复3次的N基因及ORF1ab基因Ct值均＜40，结果均为2019-nCoV阴性。

2.4 精密度

重复性验证中5.0×105copies/mL 浓度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV值分别为0.53%和0.48%；5.0×103copies/mL 浓度水平的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分别为0.75%和0.61%。批间不精密度验证中5.0×105copies/mL 浓度的N基因和ORF1ab 基因的Ct值CV分别为1.98%和2.01%；5.0×103copies/mL浓度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV为1.41%和2.15%。CV符合试剂说明书要求标准(＜5%)，精密度验证合格。

3 讨论

荧光定量聚合酶链式反应在核酸检测中具有很高的灵敏度和特异度、高通量等优点作为新型冠状病毒肺炎的确诊方法[4]，在快速诊断、疫情防控中发挥了及其重要作用。随着新冠肺炎防治的常态化，SARS-CoV-2核酸检测也更加常规化。为确保本室新型冠状病毒核酸检测结果质量的可靠，根据《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》(CNAS-CL02-A009)和《分子诊断检验程序性能验证指南》(CNAS-GL039)，核酸检测试剂进入临床使用前应进行性能验证。

本研究所验证的核酸检测试剂以2019-nCoV的ORF1ab和N基因设计特异性引物和荧光探针通过荧光定量PCR仪进行扩增，实现对新冠病毒核酸的检测。准确度是指测量结果与真实结果之间的接近程度或一致性。本研究对6份阳性质控及6份阴性质控品检测结果与真实值完全一致，说明检验结果准确可靠。精密度是在规定条件下，对同一被测对象多次重复测量所得结果的一致程度，通常以标准差或变异系数表示。本研究显示批内精密度高浓度标本的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV值分别为0.53%和0.48%；低浓度标本的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分别为0.75%和0.61%。批间精密度高浓度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分别为1.98%和2.01%；低浓度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV为1.41%和2.15%。批内精密度变异系数均在1%以内，批间精密度变异系数均在3%以内，符合厂家批内批间精密度小于5%的声明，说明试剂性能稳定，重复性好。检出限是指试剂对待测样本的检测能力，即灵敏度。验证试剂的灵敏度，即是对低浓度样本(检出限)的检出率。本研究显示样本浓度在500copies/mL的时候在检测结果均为阳性，满足说明书的检测限，说明该试剂具有足够的检测能力。最低检出限是分子诊断产品的重要指标，设置较低容易造成假阳性，设置过高容易造成假阴性[5]。因此在弱阳性样本的判断上，不同核酸检测试剂盒产品可能会得出不同结论。对于此也有研究表明不同试剂对弱阳性样本检出能力是有很大差异[6,7]。因此有研究建议对于没有灰区设置的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒，当检出的Ct值与判断阳性阈值的Ct值的差小于3时，建议进行重复实验，以排除假阳性或假阴性的可能[8]。交叉反应主要是验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测的影响，对于冠状病毒核酸检测来说，主要与检测对象核酸序列具有同源性，易引起相同或相似临床症状的病原体核酸，由于本室资源有限仅验证了甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、肠道病毒、肺炎支原体、EB 病毒、人巨细胞病毒和结核分枝杆菌无交叉反应。

虽然试剂盒上市前经过了严格的临床试验，但是进入新实验室临床检验前还需进行性能评价，以验证其产品符合其声明的范围，保证检验质量的可靠性。本研究结果表明上海伯杰医疗科技有限公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒在Lepgen-96全自动医用PCR仪上两个浓度的参考品两个靶基因的批内批间精密度均小于5%，阴阳性符合率达100%，验证了其声明的最低检出限为500copies/mL，交叉反应等参数进行基本符合临床应用要求。