微小RNA在肝脏缺血再灌注损伤中的研究进展

严启航，陈睿，黄汉飞，曾仲

(昆明医科大学第一附属医院器官移植中心，云南 昆明 650032)

0 引言

缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury，IRI)是指由于各种原因导致的组织和器官供血供氧减少，从而造成组织和器官损伤，但当供血供氧恢复后损伤反而进一步加重的病理生理过程。肝脏缺血再灌注损伤(hepaticischemiareperfusio ninjury，HIRI)多发生在休克、肝切除、肝移植等过程中，目前认为，IRI与肝移植后的早期移植物功能障碍密切相关[1]，轻度IRI可能导致17.4%的移植肝发生早期移植物功能障碍，经历重度IRI的肝脏发生早期移植物功能障碍的比例可能高达88.9%[2]，IRI亦是肝移植术后胆道狭窄的主要原因[3]。对于如何减轻IRI以保护肝脏，成为目前器官移植领域亟需解决的问题。近年来，随着对微小RNA(microRNA，miRNA)研究的不断深入，发现其在HIRI过程中起着重要的调控作用，本文就以miRNA在HIRI中的研究作用进展作一综述。

1 缺血再灌注损伤机制概述

1.1 缺血阶段

在细胞水平上，缺血引发多种病理改变：一方面，由于血流供应的中断导致细胞缺氧，从而破坏了线粒体氧化呼吸链的传递[4]；另一方面，缺氧致使线粒体低效率利用ATP进行无氧代谢，从而产生乳酸堆积、降低线粒体pH[5]。当ATP耗竭，Na+-K+泵无法通过主动转运平衡细胞内外Na+、K+离子浓度时，大量Na+会通过Na+-H+通道从细胞外进入细胞内[6]；同时，内质网上的Ca2+泵失活，限制了胞内Ca2+摄入内质网。以上使得细胞内H+、Na+和Ca2+大量累积，细胞内渗透压升高，胞内高渗透压驱使水分子从胞外进入胞内，导致肝内肝细胞、Kupffer细胞、窦内皮细胞等肿胀[7]。

1.2 再灌注阶段

在再灌注早期，由于电子传输链的破坏，大量电子泄漏导致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量生成，并引诱导Kupffer细胞激活，产生更多的ROS，并且释放TNF-α、IFN-β、IL-1、IL-12等促炎因子[8,9]。当大量的ROS聚集，体内超氧化物歧化酶不足及时将其降解，则会引起内皮细胞DNA损伤和氧化应激功能障碍，由此产生更多的羟自由基，破坏跨质膜离子梯度，造成细胞内外水电解质失衡，导致质膜破坏，胞内细胞器被释放到周围，引发细胞坏死和局部炎症反应[10]。

2 miRNA功能概述

miRNA是一类由21-23个核苷酸组成的小分子单链RNA，不具备编码蛋白的功能。在RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ的作用下于细胞核内转录相关miRNA基因得到初级miRNA(primarymicroRNA，pri-miRNA)，pri-miRNA是 长 度在数百到数千个碱基双链RNA，具有5`帽结构和3`多聚腺苷酸尾，并形成一个到多个发夹茎环结构。当双链RNA结合蛋白DGCR8识别pri-miRNA后形成Drosha-DGCR8微处理复合物，在核酸酶Drosha作用下水解pri-miRNA，将其剪切为大约70个核苷酸的前体miRNA(precursormicroRNA，pre-miRNA)。pre-miRNA通过转运蛋白exportin5从胞核转运至胞浆内，在胞浆中pre-miRNA末端的茎环结构被核酸内切酶Dicer水解切割，形成为21-23个碱基对的双链RNA(doublestrandRNA，dsRNA)，dsRNA与Argonaute2蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，dsRNA在Argonaute2作 用 下 解 开 双 链，将其中一条链从RISC释放并迅速降解，剩余的一条链则保存在RISC中成为成熟miRNA[11,12]。当miRNA与信使RNA(messengerRNA，mRNA)的3`非编码区(3` untranslated region，3`UTR)：①完全互补配对，RISC则可以降解mRNA；②不完全互补配对，RISC则抑制mRNA的翻译，从以上两种机制抑制靶基因mRNA的翻译功能，从而达到基因表达调控的作用[13,14]，miRNA通过在转录后水平对mRNA的抑制功能，实现对细胞分化、凋亡、增殖、自噬等多方面的功能调控，以发挥其生物学功能[15]。

3 miRNA与凋亡

3.1 凋亡概述

凋亡是指机体在生理或病理条件下，为了维持自身内环境的稳态，发生的基因调控下单个细胞主动、有序的死亡，同时伴有细胞皱缩、核固缩、细胞膜重塑、凋亡小体形成等一系列细胞形态学改变[16]，以及半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)、Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶以及需Ca2+蛋白酶活化等一系列生化改变，最后凋亡细胞被巨噬细胞吞噬而消亡，其发生途径可分为内源性线粒体途径和内质网途径，以及外源性死亡受体途径三条[17]。

3.2 miRNA通过线粒体途径调控HIRI中的细胞凋亡

细胞凋亡的线粒体途径主要是由于凋亡信号的传导使线粒体膜通透性转换孔道(mitochondrialpermeabilitytransiti onpore，MPTP)开放，从而改变线粒体膜的通透性，释放细胞色素c(cytochrome c，Cytc)到细胞质内，激活caspase，形成凋亡小体并发生一系列的级联反应，最终导致细胞发生程序性死亡[18,19]。

在缺氧、应激等细胞外信号的刺激下，可以激活磷脂酰肌 醇3-激 酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，Akt是PI3K重要的下游分子，由PI3K激活的Akt能促使Bcl-2与Bad分离，游离的Bcl-2通过阻止Cytc从线粒体释放到胞质中，避免caspase的激活，发挥抗凋亡的生物学功能[20]。研究显示，在HIRI模型中，miR-124能通过靶向抑制Rab38从而激活PI3K/Akt，上调Bcl-2，进而抑制caspase-3的活化，以抑制细胞发生凋亡[21]；miR-494通过磷酸酶与张力 蛋 白 同 源 物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)激活PI3K/Akt，抑制多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)和caspase-3，减 轻 肝 损 伤[22]；miR-21能通过PTEN激活PI3K/Akt信号通路，抑制糖原合成酶激 酶-3b(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3b)，减 少caspase-3和caspase-9的表达，从而抑制线粒体途径细胞凋亡的启动[23]；miR-142-3p通过MARCKS/PI3K/Akt信号途径上调Bcl-2，下调caspase-3，减轻凋亡以保护HIRI后的肝功能；miR-494升高能激活PI3K/Akt，诱导下游低氧诱导因子-1a(hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1a)和 血 红 素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)表达上调，caspase-3和caspase-7表达下调，减轻细胞在缺氧应激情况下的凋亡[24]；miR-27a-5p通过靶向Bach1增加HO-1的表达，上调Bcl-2发挥抗凋亡功能[25]。

Bax作为主要的促凋亡蛋白之一，在凋亡信号的刺激下，Bax可转位至线粒体膜并形成聚合物，开放MPTP并释放Cytc，在dATP存在条件下，Cytc与凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)结合，招募caspase-9在其上形成寡聚物，进而激活caspase-3，启动级联反应，促使细胞凋亡[26]。研究显示，通过干扰锌指E-盒结合同源异型盒蛋白1(zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1)能上调Bax的表达[27]，Wu，Y等[28]证实miR-200c可以靶向干扰ZEB1的表达，并在H2O2诱导的细胞模型以及动物HIRI模型中通过抑制和过表达miR-200c，揭示了miR-200c能通过抑制ZEB1上调PARP和caspase-3的表达，诱导细胞凋亡发生。另一项研究中，Xiao，Y等[29]通过miR-219a-5p抑制肿瘤蛋白p53结合蛋白2(tumorproteinp53 bindingprotein 2，TP53BP2)，抑制TP53转录活性，下调Bax和p21表达，减轻凋亡，从而减轻HIRI中肝细胞损伤。

转录因子Nfib的抗凋亡作用在多种肿瘤中均有报道[30-32]，Roy，S等[33]通过小鼠HIRI模型和细胞氧化应激模型，并结合急性肝衰竭患者的资料，充分证实了miR-1224在IRI过程能够靶向Nfib从而抑制其抗凋亡功能，增加肝损伤，同时还发现miR-1224特异性来自肝细胞，血清含量变化与ALT、AST变化水平一致，可以作为反映肝细胞损伤的生物标志物。

凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)可以和释放的Cytc结合发生寡聚化，并与caspase-9结合形成凋亡小体，介导细胞发生凋亡。miR-183可以通过靶向Apaf-1从而抑制下游caspase-9和caspase-3的活化，下调ALT、AST活性，发挥护肝功能[34]。

3.3 miRNA通过内质网途径调控HIRI中的细胞凋亡

内质网是细胞内蛋白质合成、加工、修饰并折叠成熟的主要场所，内质网作为细胞内重要的Ca2+储存细胞器，在维持细胞Ca2+离子稳定方面起到重要的作用。如果内质网腔内Ca2+离子发生失衡、错误折叠或未折叠蛋白增多，均会引起内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)，过度的ERS会触发细胞内的凋亡信号，促使细胞凋亡。ERS主要由肌醇需求酶1(inositolrequiringenzyme 1，IRE1)、蛋白激酶R样内质网激酶(PRKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和活化转录因子6(activatingtranscriptionfactor 6，ATF6)介导[35]。当发生ERS时，非折叠蛋白或错误折叠蛋白与IRE1、PERK、ATF6竞争性结合葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78kD，GRP78)，使IRE1、PERK、ATF6解离从而激活下游信号通路。过度的ERS可以激活CCAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCATenhancerbindingproteinhomologousprotein，CHOP)和caspase-12，从而诱导细胞凋亡的发生[36]。

研究报道过氧化物酶体增殖剂激活受体g(peroxisome proliferatoractivated receptorgamma，PPARg)可 以 作 为HIRI的一个治疗靶点[37,38]，而miR-27a能够靶向抑制PPARg[39]，进一步研究发现，在大鼠HIRI模型中通过抑制miR-27a能下调GRP78和CHOP的表达，降低血清ALT、AST含量，TUNEL检测显示肝组织凋亡细胞减少，而进一步沉默PPARg，使GRP78和CHOP表达上调，发生ERS，加重细胞凋亡与坏死程度，说明miR-27a对大鼠HIRI的保护作用通过是PPARg调控内质网途径的细胞凋亡实现[40]。另一项研究中，用小鼠建立HIRI模型和用巨噬细胞细胞系建立细胞低氧/复氧(hypoxia reoxygenation，H/R)模型，过表达miR-199a-5p后ERS相关GRP78、ATF6、IRE1和CHOP在mRNA水平和蛋白水平表达量均发生下调[41]。

3.4 miRNA通过死亡受体途径调控HIRI中的细胞凋亡

死亡受体是锚定在细胞膜上的跨膜蛋白，其胞外部分的结构富含半胱氨酸，胞内部分则含有具有蛋白水解功能的死亡结构域[42]。当死亡受体的胞外部分接受到凋亡刺激信号后，将信号传递至胞内，由死亡受体招募TRADD、TRAF1/2、cIAP1/2、RIP1等衔接蛋白，激活caspase-8，并进一步激活caspase-3、caspase-7启动凋亡[43]。

高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupbox 1，HMGB1)是晚期炎症的标志物，可以促使核因子活化B细胞k轻链增强子(nuclear factor-kappa B，NF-kB)活化，释放TNF-a，通过与TNF受体结合向胞内传递死亡信号，启动细胞凋亡。在大鼠HIRI模型中，miR-449b-5p通过靶向HMGB1抑制其表达，进而通过减少NF-kB的激活，降低caspase-3、caspase-9的表达，减轻肝损伤[44]。而miR-9-5p能直接通过靶向NF-kB抑制凋亡[45]，miR-214则能抑制传递信号到胞内的重要蛋白TRAF1，通过负调节TRAF1/ASK1/JNK通路抑制HIRI后的肝细胞凋亡[46]。

4 miRNA与自噬

4.1 自噬概述

自噬是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬小体为特征的细胞程序性死亡。正常情况下，哺乳动物雷帕霉素靶标(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)处于活化状态，通过磷酸化ULK1蛋白激酶复合体而抑制自噬的发生，在饥饿、氧化应激、蛋白折叠错误等情况下，mTOR失活使ULK1发生去磷酸化，诱导自噬启动[47,48]。激活的ULK1使Beclin1发生磷酸化，并与Vps34和Vps15结合形成Vps34-Vps15-Beclin1复合物，招募Atg12-Atg5-Atg16L复合物定位至自噬泡外膜。同时，在诱导自噬以后，胞浆可溶形式的自噬微管相关蛋白轻链3-I(microtubule-associatedprotein 1 lightchain 3-I，LC3-I)在Atg7、Atg3以 及Atg12-Atg5-Atg16L复合物的作用下与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺相耦联形成LC3-Ⅱ，并锚定在自噬体膜上，其含量随自噬体膜的增多而增加，是自噬体的重要分子标志[49]。LC3-Ⅱ通过与结合了泛素化寡蛋白的p62相结合，从而将泛素化寡蛋白包裹进自噬泡，自噬泡进一步与溶酶体融合成为自噬溶酶体，降解自噬底物[50]。

4.2 miRNA在HIRI中对自噬的调控

研究报道，在小鼠HIRI模型中过表达miR-30b-5p能有效改善IRI后的肝损伤，进一步研究发现miR-30b-5p可以通过结合Atg12 mRNA的3`UTR抑制其翻译，通过建立H/R细胞模型进行机制研究，发现过表达miR-30b-5p后Atg12-Atg5和LC3-Ⅱ表达降低，细胞活力增加，而抑制miR-30b-5p后Atg12-Atg5和LC3-Ⅱ表达则升高，细胞活力下降，证明miR-30b-5p在HIRI中能抑制自噬保护肝细胞[51]。另一项研究揭示了发生HIRI后，miR-17可以通过靶向Stat3上调Beclin1和LC3B-Ⅱ，下调p62，通过激活自噬加重肝细胞损伤[52]。Sun，X. L等[53]建立HIRI模型小鼠，并在2h、6h、12h、24h取材进行检测分析，发现在肝组织损伤最严重的12h时间点上，LC3-Ⅱ和PGAM5上调最明显，而p62和miR-330-3p下调最明显，进一步在小鼠模型上过表达miR-330-3p，能明显减轻IRI后的肝损伤，通过在H/R细胞模型上进行机制探索，揭示了miR-330-3p能够靶向PGAM5，通过抑制线粒体自噬减轻IRI后的肝损伤。Song，H等[54]人的研究发现，HIRI过程中，miR-101可以通过激活mTOR抑制自噬发生，减轻细胞损伤。Zhang，L等[55]则揭示了miR-20a通过抑制Beclin-1在自噬体膜成膜延伸阶段抑制自噬，减轻HIRI后的肝损伤。

5 miRNA与ceRNA机制

5.1 ceRNA机制概述

竞争性内源RNA(competingendogenousRNA，ceRNA)可以通过竞争性结合miRNA来更精细的调节基因表达。当内源性长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)、环状RNA(circularRNA，circRNA)等RNA存在相关的miRNA应答元件(microRNAresponseelement，MRE)，就可以与相应miRNA发生竞争性结合，从而间接调控 miRNA对靶mRNA的负性调控作用，这种竞争性结合miRNA又被称为miRNA海绵作用[56,57]。

5.2 lncRNA在HIRI中对miRNA的调控

lncRNA通常定义为长度在200个核苷酸以上，且不编码蛋白质的转录本，能通过参与转录激活、转录抑制、染色质重塑、RNA剪切等过程发挥相应的生物学功能[58]。通过RNA下拉实验，Huang，X等[59]证实了lncRNAMEG3与miR-34a存在相互作用，并通过过表达、敲低以及功能回复实验，在动物模型和细胞模型上均证明了HIRI过程中，lncRNAMEG3通过负性调控miR-34a，从而上调其靶基因Nrf2的表达，增加细胞凋亡，并增加了ALT、AST活性。Dai，B等[41]发现lncRNAAK054386通过海绵吸附miR-199，在HIRI过程中上调了GRP78、ATF6、IRE1a和CHOP的表达，从而发生ERS，加重肝细胞损伤。lncRNAHOTAIR通过吸附miR-20b-5p上调Atg7的表达，增加细胞自噬[60]。lncRNAGm4419在HIRI中通过miR-455上调SOX6，从而促进Bax并抑制Bcl-2的表达，促进细胞凋亡，增加肝损伤[61]。

5.3 circRNA在HIRI中对miRNA的调控

circRNA是具有闭合环状结构的非编码RNA，主要由mRNA前体的外显子经反向剪接环化而成，其在体内表达稳定，不易降解，能通过内源性竞争结合miRNA、调控可变剪切、调控亲本基因表达等途径发挥其生物学功能[62,63]。Zhang P等[64]通过小鼠HIRI模型，用微阵列杂交找到差异表达的circRNA，联合GO、KEGG富集分析，并进一步用qRTPCR扩增验证，筛选出6个circRNA，构建circRNA-miRNAmRNA互作网络图，最终预测筛选出mmu_circRNA_005186-miR-124-3p-Epha2调控轴进行实验验证。用双荧光素酶报告基因检测和qRT-PCR证明mmu_circRNA_005186通过海绵作用miR-124-3p增强了Epha2的表达水平，用针对mmu_circRNA_005186的siRNA转染RAW 264.7细胞系48h再用LSP刺激，检测到TNF-α和IL-1β明显低于对照组，而miR-124-3p上调6倍，Epha2表达水平明显下降。该研究揭示了mmu_circRNA_005186可以通过海绵吸附miR-124-3p，从而间接促进Epha2的功能，减轻HIRI后的细胞损伤。

6 总结与展望

目前在HIRI研究领域，有更多的人将目光投向了miRNA，这些研究进一步揭示了miRNA在HIRI过程中参与的精密调控作用。除此之外，miRNA还有作为生物标志物极大的潜力，比如在HIRI发生过程中，有miR-122[65-70]、miR-1224[33]、miR-370[71-73]、miR-155[74-76]、miR-21[23,69,77]、miR-223[69,78]、miR-450b-5p等[79]上调，而miR-146a[80]、miR-182-3p[81]、miR-24-3p等[82]下调，其中miR-122和miR-1224，其表达量不仅与肝细胞损伤程度一致，而且还是在肝脏特异表达的miRNA，有极大的作为HIRI分子标志物的潜力。而在通过miRNA减轻HIRI的药物治疗方面，七氟烷可以通过上调miR-9-5p，抑制NF-kB通路而抑制细胞凋亡[45]，可以通过下调miR-200c抑制细胞凋亡[28]；异丙酚通过上调miR-33a-5p，抑制MAPK6的表达发挥抗凋亡作用[83]。生物治疗方面，也有关于使用间充质干细胞通过miR-370[73]、miR-20a[55]、miR-19a[84]改善HIRI。目前miRNA对HIRI机制调控的研究还处于细胞实验和动物实验阶段，对于在临床上如何以miRNA为靶点改善HIRI，其有效性和安全性又如何，有待进一步深入研究，不过这也为我们如何减轻HIRI以及能否利用miRNA评估肝损伤提供了一个思路。