高抗氧化活性大果山楂发酵液的发酵工艺优化

程天德 谢庆彤 游丽君

(1. 清远职业技术学院食品药品学院，广东 清远 511510；2. 华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640)

大果山楂是一种有着悠久历史的药食两用水果，与中国传统中药山楂具有相似的成分和功效，在欧洲、中国和美国等地均有种植，已被证实具有抗氧化和降血脂等功效[1-3]。大果山楂既可鲜食，也可加工成山楂粉、山楂果脯、山楂干、山楂饼、山楂酒、山楂醋、山楂罐头等[4-6]。虽然大果山楂具有较高的营养价值，但由于大果山楂的味道酸涩，山楂干、山楂饼等粗加工产品难以被消费者广泛接受，因此需要研究可以改善大果山楂风味的深加工技术。杨静云等[7]研究了山楂固态发酵工艺，王彦安[8]研究了山楂果醋发酵工艺，张巧等[9-10]研究了大果山楂酵素发酵工艺，上述研究结果均表明大果山楂经发酵处理后风味得到了改善，但由于其采用的是固态发酵工艺和自然菌种发酵，加工过程耗时长，产品质量不稳定，且没有对能够体现大果山楂主要功效的抗氧化能力进行系统研究，不利于产品的功能性评价。为了深入研究大果山楂液体深层发酵工艺，得到质量稳定、总体抗氧化能力强的大果山楂发酵液，研究拟采用主成分分析法构建大果山楂发酵液抗氧化能力综合评价模型，以大果山楂发酵液的综合抗氧化能力值为评价指标，优化高抗氧化活性大果山楂发酵液的发酵工艺条件，旨在为大果山楂抗氧化类功能食品的研究与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 大果山楂

采摘于广东省连山县某大果山楂种植基地(2019年10月)，鲜大果山楂采摘后于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2 主要试剂

鼠李糖乳杆菌(CBS98073)：广东环凯微生物科技有限公司；

福林酚试剂、2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)：分析纯，美国Sigma公司；

没食子酸、儿茶素、维生素E水溶性类似物(Trolox)：标准品，美国Sigma公司；

熊果酸、抗坏血酸：标准品，上海纯晶生化科技股份有限公司；

四氯对苯醌、硼氢化钠：分析纯，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 主要仪器

高速组织捣碎机：DS-1型，上海精科实业有限公司；

高压灭菌锅：LDZF-100L-III型，上海申安医疗器械厂；

多功能提取浓缩机组：EC-02A型，杭州恩创机械有限公司；

发酵罐：ZY-800型，上海紫裕生物科技有限公司；

离心机：TGL-20M型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

分光光度计：UV1800型，上海菁华科技仪器有限公司；

氮吹仪：PGG-01G型，天津艾维欧科技发展有限公司；

旋涡混合仪：MS1型，德国IKA公司；

多功能酶标仪：Filter Max F型，美国Molecular公司。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种活化培养 鼠李糖乳杆菌于-80 ℃冰箱中保存备用，试验前将鼠李糖乳杆菌接种到MRS肉汤培养基中活化传代，37 ℃静置培养24 h，取培养液于4 ℃、4 500 r/min 离心20 min，收集菌体，用0.85%的生理盐水洗涤2次，混匀制成菌悬液(>109CFU/mL)供后续试验使用。

1.4.2 发酵工艺

(1) 工艺流程：

大果山楂→洗净→去核→打浆→调配→灭菌→接种→发酵→离心→大果山楂发酵液

(2) 操作要点：选取设定量的大果山楂清洗晾干，去核去梗打浆后置于60 L 0.2%的抗坏血酸溶液中护色，加入2.5 kg白砂糖混合均匀后转移至100 L发酵罐中，121 ℃ 灭菌20 min，冷却至室温，用2 mol/L的HCl(或NaOH)溶液调节pH至设定值，接入设定量的鼠李糖乳杆菌(LGG)菌悬液，于设定温度下进行发酵。

1.4.3 指标测定

(1) 总酚含量：采用Folin-Ciocalteu比色法[11]，分别采用50，100，150，200，250，300 μg/mL的没食子酸溶液在760 nm下制作没食子酸标准曲线。线性回归方程为y=0.376x+0.032，R2=0.999 2。

(2) 总黄酮含量：采用硼氢化钠—四氯苯醌(SBC)比色法[12]，分别采用0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mg/mL 的儿茶素标准溶液在490 nm下制作儿茶素标准曲线。线性回归方程为y=0.481 7x+0.005 3，R2=0.998 9。

(3) 总叁萜含量：参照Khishova等[13]的方法进行测定，分别采用10，20，30，40，50 μg/mL的熊果酸标准溶液在548 nm下制作熊果酸标准曲线。线性回归方程为y=0.011 2x+0.056，R2=0.995 6。

(4) 氧自由基吸收能力(ORAC)：参照Wen等[14]的方法进行测定，以Trolox为标准品制作标准曲线，每个样品平行测定3次取平均值。样品的ORAC值表示为每克大果山楂干重的Trolox当量(μmol TE/g DW)。

(5) 过氧自由基清除能力(PSC)：参照Adom等[15]的方法进行测定，以现配的抗坏血酸(VC)和没食子酸(GA)为抗氧化标准物质，以磷酸缓冲溶液代替抗氧化物质进行空白试验，每个样品平行测定3次取平均值。样品的PSC值表示为每克大果山楂干重的VC当量(μmol VCE/g DW)。

(6) DPPH自由基(DPPH·)清除率：参照Blois[16]的方法进行测定，将待测样品溶液与2×10-4mol/L的DPPH溶液等体积混合，室温下静置30 min，以蒸馏水作为参比，于517 nm下测定吸光度，通过计算得出DPPH自由基清除率。

(7) ABTS自由基(ABTS+·)清除率：参照王存堂等[17]的方法进行测定，取5 mL 7×10-3mol/L的ABTS，加入8.8 μL 1.4 mol/L的K2S2O8，充分混合后静置16 h即得ABTS工作液。分别取50 μL待测液(相同浓度发酵液)和5 mL ABTS工作液于试管中，摇匀静置10 min后于734 nm处测定吸光度，以不加样品的ABTS工作液作为参比，平行测定3次取平均值，通过计算得出ABTS自由基清除率。

1.4.4 抗氧化能力综合评价模型的建立 按20 g/100 mL发酵液的大果山楂添加量、5 mL/100 mL发酵液的LGG接种量，在25 ℃、初始pH 6.0的条件下发酵56 d，每7 d取样一次，4 500 r/min离心10 min，取上清液检测其总黄酮含量、总酚含量、总三萜含量、ORAC、PSC、DPPH·和ABTS+·清除能力。参照程天德等[18]的方法进行主成分分析，构建大果山楂发酵液抗氧化能力综合评价模型。

1.4.5 单因素试验

(1) 大果山楂添加量对发酵液抗氧化活性的影响：在25 ℃、初始pH 6.0、LGG接种量5 mL/100 mL发酵液的条件下，分别按5，10，15，20，25 g/100 mL发酵液的量添加大果山楂。

(2) LGG接种量对发酵液抗氧化活性的影响：在25 ℃、初始pH 6.0、大果山楂添加量20 g/100 mL发酵液的条件下，分别按1，3，5，7，9 mL/100 mL发酵液的浓度接种LGG菌悬液。

(3) 发酵温度对发酵液抗氧化活性的影响：在20 g/100 mL 发酵液的大果山楂添加量、5 mL/100 mL发酵液的LGG接种量、初始pH 6.0的条件下，分别在15，20，25，30，35 ℃下进行发酵。

(4) 初始pH对发酵液抗氧化活性的影响：在25 ℃、20 g/100 mL发酵液的大果山楂添加量、5 mL/100 mL发酵液的LGG接种量的条件下，分别以pH 2.0，3.0，4.0，5.0，6.0的初始pH进行发酵。

每组样品均发酵56 d，每7 d取样一次，4 500 r/min离心10 min，取上清液检测其总黄酮含量、总酚含量、总三萜含量、ORAC、PSC、DPPH·清除率和ABTS+·清除率，采用大果山楂发酵液抗氧化能力综合评价模型计算出发酵液的抗氧化能力综合评价得分。

1.4.6 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，以大果山楂添加量、LGG接种量、发酵温度和初始pH为主要影响因素，以发酵液的抗氧化能力综合评价得分为评价指标设计响应面试验，确定最优的高抗氧化活性大果山楂发酵液发酵工艺条件。

1.5 数据分析

采用Excel软件进行数据统计分析，用Design-Expert 8.0软件进行响应面分析，各组试验结果数据均以平均数表示。

2 结果与分析

2.1 抗氧化能力综合评价模型

2.1.1 抗氧化指标检测结果 大果山楂发酵液中主要抗氧化指标检测结果如表1所示。由表1可知，随着发酵时间的延长，总酚、总黄酮和总叁萜含量都有不同程度的提高，发酵液的ORAC、PSC、DPPH·清除率和ABTS+·清除率也随之提高，说明在试验设定的发酵期限内，大果山楂发酵液的抗氧化能力有所提高。

表1 大果山楂发酵液主要抗氧化指标检测结果Table 1 Test results of main antioxidant indexes of Malus doumeri fruits fermented beverage

2.1.2 抗氧化指标统计分析 大果山楂发酵液的抗氧化指标统计分析结果如表2所示。由表2可知，ABTS+·清除率、DPPH·清除率和总黄酮含量3个指标的变异系数较高，分别达到26.67%，16.30%，13.39%，其他指标的变异系数均低于5%。

表2 大果山楂发酵液的抗氧化指标统计分析结果†Table 2 Statistical analysis results of antioxidant index of Malus doumeri fruits fermented beverage

2.1.3 抗氧化能力综合评价的主成分分析 为了消除7种抗氧化指标之间的量纲和数量级差异，采用标准差标准化法对各指标的检测数据进行标准化处理，即：

(1)

式中：

k——该指标的标准化值；

X——该指标的测定值；

b——该指标的标准差(SD)。

从表3可以看出，前3个主成分的累计方差贡献率已经达到82.36%，基本涵盖了7项主要抗氧化指标的数据信息，达到了提取主成分因子的标准，因此选取前3个主成分。

表3 特征值与方差贡献率Table 3 Contribution rate of characteristic value and variance

2.1.4 抗氧化能力综合评价模型 由表4可知，决定第1主成分的主要是总黄酮含量、PSC和DPPH·清除率，决定第2主成分的主要是总酚含量、ORAC、PSC和DPPH·清除率，决定第3主成分的主要是总三萜含量、ABTS+·清除率和DPPH·清除率，推测可能是因为指标之间的相关性比较高，这些指标才会出现在同一主成分中。

根据表4中主成分的特征向量，可将3个主成分分别表示为：

表4 主成分的特征向量†Table 4 Eigenvectors of principal components

第1主成分：F1=-0.132X1+0.723X2+0.032X3-0.187X4+0.626X5+0.586X6+0.118X7；

(2)

第2主成分：F2=0.825X1-0.154X2+0.065X3+0.752X4+0.536X5+0.605X6+0.018X7；

(3)

第3主成分：F3=-0.086X1+0.118X2+0.776X3+0.107X4+0.124X5+0.596X6+0.645X7。

(4)

大果山楂发酵液的综合抗氧化能力值：

F综合=1.214 2×(0.386 2F1+0.241 2F2+0.196 2F3)。

(5)

2.2 单因素试验

2.2.1 大果山楂添加量对发酵液抗氧化活性的影响 由图1可知，发酵前期，大果山楂发酵液的抗氧化活性逐渐提高，尤其是0～21 d，提高的幅度尤为明显，可能是由于细胞破裂，大果山楂中的主要活性成分不断溶出造成的，也有可能是由于原本的大分子物质被分解成小分子，从而在检测结果上显示出含量增加的现象[19]。发酵后期，这些活性成分含量出现了小幅下降，可能是由于被氧化或被降解造成的。发酵液的抗氧化能力随大果山楂添加量的增加而增强，这种现象在5～20 g/100 mL发酵液的大果山楂添加量组中比较明显，但在20～25 g/100 mL发酵液的大果山楂添加量组中不显著，综合考虑，拟采用20 g/100 mL发酵液左右的大果山楂添加量进行响应面优化试验。

图1 大果山楂添加量对大果山楂发酵液抗氧化活性的影响

2.2.2 LGG接种量对发酵液抗氧化活性的影响 由图2可知，发酵初期，LGG接种量大的试验组抗氧化能力值较大，但发酵后期这种差异不明显，LGG接种量5～9 mL/100 mL 发酵液试验组的变化曲线基本重合，说明过多的LGG接种量对大果山楂发酵液的抗氧化能力影响有限，因此选择5 mL/100 mL 发酵液左右的LGG接种量进行响应面优化试验。

图2 LGG接种量对大果山楂发酵液抗氧化活性的影响

2.2.3 发酵温度对发酵液抗氧化活性的影响 由图3可知，25 ℃和30 ℃试验组的抗氧化能力值显著高于其他试验组，且在第0～28天这两组的抗氧化能力值变化曲线几乎重合，28 d之后25 ℃试验组的抗氧化能力值超过了30 ℃试验组，因此考虑在25 ℃左右进行响应面优化试验。

图3 发酵温度对大果山楂发酵液抗氧化活性的影响

2.2.4 起始pH对发酵液抗氧化活性的影响 由图4可知，起始pH 4.0，5.0，6.0试验组的抗氧化能力值明显高于其他试验组，且这3组的抗氧化能力值出现了交替领先的现象，因此考虑在起始pH 5.0左右进行响应面优化试验。

图4 起始pH对大果山楂发酵液抗氧化活性的影响

综合单因素试验结果，得出了响应面试验的因素与水平，即大果山楂添加量15～25 g/100 mL发酵液、LGG接种量3～7 mL/100 mL发酵液、起始pH 4.0～6.0、发酵温度20～30 ℃，各试验组大果山楂发酵液的抗氧化能力值在第0～28天增速较快，之后增幅逐渐放缓，从工业化生产的效率和效益方面考虑，发酵时间确定为28 d。

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面模型的建立 以单因素试验为依据，设计大果山楂发酵的响应面优化试验因素与水平，如表5所示。

表5 大果山楂发酵的响应面优化试验因素水平表

2.3.2 试验结果及方差分析 大果山楂发酵的响应面优化试验结果如表6所示。

表6 大果山楂发酵的响应面优化试验结果

由表7可知，模型的P值<0.000 1，说明回归性极显著，结果可信。失拟项P值(0.927 5)>0.05，说明模型的相对误差较小，能够较好地预测分析大果山楂发酵工艺。因素A、C和D对结果有显著性影响，因素B对结果的影响不显著，各因素对大果山楂发酵液抗氧化能力影响的大小顺序为：A>D>C>B。采用Design-Expert 8.0软件对回归模型进行预测分析，将大果山楂发酵液抗氧化能力综合评分的分值设置得尽可能大，得出最佳发酵工艺：起始pH 5.10、LGG接种量5.05 mL/100 mL发酵液、大果山楂添加量20.15 g/100 mL发酵液、发酵温度29.83 ℃，此时预测的大果山楂发酵液抗氧化能力综合评分为3.46分。为了方便操作，在起始pH 5. 0、LGG接种量5 mL/100 mL 发酵液、大果山楂添加量20 g/100 mL发酵液、30.0 ℃条件下进行3次验证实验，发酵时间均为28 d，所得结果的平均值为3.42分，与理论值3.46分无显著性差异，表明该预测模型科学可行。

表7 大果山楂发酵的响应面试验方差分析结果†Table 7 The results of analysis of variance of response surface test of Malus doumeri fruits fermentation

3 结论

(1) 大果山楂发酵液的抗氧化能力评价模型为：F综合=1.214 2×(0.386 2F1+0.241 2F2+0.196 2F3)，高抗氧化活性大果山楂发酵液的最佳发酵工艺为：起始pH 5.0，发酵温度30 ℃，大果山楂添加量20 g/100 mL发酵液、鼠李糖乳杆菌接种量5 mL/100 mL发酵液、发酵时间28 d，该工艺所得大果山楂发酵液的F综合=3.42。

(2) 试验采用主成分分析法对可能影响大果山楂发酵液抗氧化活性的7项指标进行了分析，构建了大果山楂发酵液抗氧化能力的综合评价模型，该模型中的3个主成分分别反映了大果山楂发酵液中不同成分对抗氧化能力的贡献，虽然DPPH·清除率与大果山楂发酵液中的主要活性成分(总黄酮、总酚、总三萜)都有关联，但其与总黄酮、总三萜含量的关联度更高，说明仅用DPPH·清除率作为评价指标无法准确地反映大果山楂发酵液中总酚及其他成分对总抗氧化能力的贡献。

(3) 大果山楂发酵液中的活性物质含量决定其抗氧化能力，试验测定的是总黄酮、总酚和总三萜3类物质的含量，但具体是这3类物质中的哪些化合物对大果山楂发酵液的抗氧化能力起主导作用，目前还不清楚，后续计划通过HPLC法鉴定大果山楂发酵液中的各种化合物，明确各活性物质对其抗氧化能力的具体影响。