云南分心木总黄酮提取及抗氧化和对脂肪变性L02肝细胞的作用

张 凤 马雅鸽 张 希 杨婧娟 赵声兰

(云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500)

分心木又称核桃隔膜，为胡桃科植物胡桃(JuglansregiaL.)的木质隔膜，富含黄酮类化合物，有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降低血糖及抗心脑血管疾病等作用[1-3]。目前已有针对河北、新疆和甘肃等地的分心木黄酮提取及抗氧化活性的报道[4-6]，但未见有关分心木黄酮提取物体外降脂功效的研究报道。

中国核桃种植面积和产量世界第一，云南省又居全国之首，其种植面积2.87×106hm2，年产量超过8.50×105t，分心木占整个核桃的4%～5%，云南每年产生3.40×103～4.25×103t分心木[7-8]，目前大多分心木被丢弃或焚烧，仅有少量被开发为袋泡茶、速溶茶和保健功能酒[9-10]。试验拟采用生产成本低且适用于大批量工业生产的乙醇回流提取法提取分心木总黄酮，采用单因素结合响应面试验优化提取工艺，并研究分心木总黄酮的体外抗氧化活性及降低脂肪变性L02肝细胞TC和TG的活性，以期为分心木功能产品的开发提供理论依据，为延长核桃产业链提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

分心木：南涧县红云核桃加工销售有限责任公司；

芦丁：对照品，上海伊卡生物技术有限公司；

福林酚试剂、抗坏血酸(VC)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

DPPH：美国Sigma公司；

人正常L-02肝细胞株：中国科学院昆明动物研究所；

胎牛血清：浙江天航生物科技有限公司；

非诺贝特：法国利博福尼制药公司；

RPMI 1640培养液、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)测定试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司;

20%医用脂肪乳：四川科伦药业股份有限公司；

医用脂肪乳诱导液：20%医用脂肪乳5 mL，用10%胎牛血清稀释至50 mL。

1.1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计：UV-180型，上海精密科学仪器有限公司；

离心机：TD5A-WS型，湖南湘仪实验室仪器有限公司；

酶标仪：INFINITE M200 PRO型，瑞士TECAN公司；

CO2培养箱：MCO-20AIC型，日本三洋有限公司；

倒置显微镜：Nikoneclipse TS 100型，尼康仪器(上海)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 分心木总黄酮提取工艺流程

分心木→粉碎→过筛(60目)→乙醇回流提取→过滤→离心(2 900 r/min，6 min)→分心木总黄酮提取液

1.2.2 总黄酮提取得率测定 根据梁杏等[11]的方法，以芦丁溶液质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线为：y=0.010 3x+0.013 6，相关系数R2=0.997 6，表明芦丁溶液质量浓度与吸光度呈现良好的线性关系。按式(1)计算分心木总黄酮提取得率。

(1)

式中：

E——分心木总黄酮提取得率，%；

C——提取液黄酮的质量浓度，μg/mL；

V——提取液体积，mL；

N——稀释倍数；

M——分心木质量，g。

1.2.3 单因素试验 预试验表明提取次数为2次的分心木总黄酮提取得率较提取1次和3次的高，故试验将提取次数固定为2次。

(1) 提取时间对分心木总黄酮提取得率的影响：分别称取2.000 0 g分心木5份，于液固比(V乙醇∶m分心木)为40∶1 (mL/g)、乙醇浓度60%和60 ℃条件下，分别回流提取20，40，60，80，100 min，回流提取2次，计算总黄酮提取得率。

(2) 乙醇浓度对分心木总黄酮提取得率的影响：分别称取2.000 0 g分心木8份，按液固比(V乙醇∶m分心木)为40∶1 (mL/g)，分别加入浓度为15%，25%，35%，45%，55%，65%，75%，85%乙醇，于60 ℃及上述确定的提取时间，回流提取2次，计算总黄酮提取得率。

(3) 液固比对分心木总黄酮提取得率的影响：分别称取2.000 0 g分心木6份，于60 ℃及上述确定的提取时间和乙醇浓度，液固比(V乙醇∶m分心木)分别为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 (mL/g)，回流提取2次，计算总黄酮提取得率。

(4) 提取温度对分心木总黄酮提取得率的影响：分别称取2.000 0 g分心木6份，按上述确定的提取时间、乙醇浓度和液固比，分别于40，50，60，70，80，90 ℃回流提取2次，计算总黄酮提取得率。

1.2.4 响应面试验 在单因素试验基础上，运用Design Expert 8.0.6设计响应面试验，以提取时间、乙醇浓度和提取温度为因素，总黄酮提取得率为响应值优化提取条件。

(2)

式中：

K1——H2O2清除率，%；

A0——不加样品的H2O2溶液吸光度值；

A1——加样品的H2O2溶液吸光度值；

A2——不加H2O2溶液的样品组吸光度值。

(3)

式中：

ΔA对照——1 min内对照管吸光度的变化值；

ΔA样品——1 min内对照管吸光度的变化值。

(4)

式中：

K3——·OH清除率，%；

A0——试剂未损伤管吸光度值；

A1——试剂损伤管吸光度值；

A2——样品未损伤管吸光度值；

A3——样品损伤管吸光度值。

(5)

式中：

K4——DPPH清除率，%；

A1——4 mL DPPH溶液+4 mL样品溶液的吸光度值；

A2——4 mL样品提取液+4 mL乙醇的吸光度值；

A3——4 mL DPPH溶液+ 4 mL乙醇的吸光度值。

1.2.6 对脂变L02肝细胞总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的影响 采用医用脂肪乳诱导正常L-02肝细胞构建脂肪变性L-02肝细胞模型。按曹丽娟等[13]的方法，取对数生长期L-02肝细胞，用G0液进行饥饿处理24 h，造模组给予医用脂肪乳诱导液培养48 h，对照组给予正常培养液培养48 h，得脂肪变性L-02肝细胞。将脂肪变性L-02肝细胞分为模型组、阳性药组和给药组，对照组和模型组给予G0液2 mL，阳性药组给予非诺贝特2 mL，给药组则分别给予2 mL 300 μg/mL和400 μg/mL分心木总黄酮。每个浓度设3个复孔，给药后继续培养24 h，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2～3次，1.5 mL离心管收集刮取的细胞，按照试剂盒的说明书测定TC和TG含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 分心木总黄酮提取工艺优化

2.1.1 单因素试验 图1(a)显示，随着提取时间的延长，总黄酮提取得率先升高后降低，80 min时总黄酮提取得率最高9.01%，在20～80 min时，分心木细胞壁逐渐被破坏，总黄酮物质溶出逐渐增加，提取得率逐渐提高，之后再继续延长提取时间，其他非黄酮类物质溶出，同时长时间加热破坏了溶出的黄酮，导致总黄酮提取得率下降[14]，故提取时间初步选择80 min。图1(b)显示，随着乙醇浓度的增大，总黄酮提取得率呈先升高后下降趋势。适当提高乙醇浓度，溶剂与总黄酮的极性靠近，总黄酮容易被提取出来，提取得率升高[15]，55%乙醇总黄酮提取得率最高7.093%，但乙醇浓度超过55%后，乙醇浓度增加，溶液沸点降低且高浓度乙醇和总黄酮的极性相差较大，不利于黄酮的提取，同时醇溶性杂质溶出增加，导致总黄酮提取得率下降[16]，故乙醇浓度初定为55%。图1(c)显示，40～80 ℃，温度升高总黄酮提取得率增加，80 ℃总黄酮提取得率达到最高值10.34%。温度高于80 ℃后，总黄酮提取得率随温度的升高反而下降，温度过高，乙醇挥发增加，使乙醇浓度降低及温度过高杂质溶出增加，导致总黄酮提取得率下降[17]，故初步确定提取温度80 ℃。图1(d) 显示，随液固比增加，总黄酮提取得率先升高后下降，在液固比(V乙醇∶m分心木)20∶1～40∶1 (mL/g)范围，增加溶剂用量到液固比(V乙醇∶m分心木)40∶1 (mL/g)时，总黄酮提取得率最高9.92%，之后继续增加溶剂反而会使其他醇溶性杂质容易溶解，使总黄酮提取得率下降，且溶剂过多增加回收成本，故液固比(V乙醇∶m分心木)取40∶1 (mL/g)。

图1 乙醇浓度、提取时间、温度和液固比对分心木总黄酮提取得率的影响Figure 1 Effects of ethanol concentration,extraction time, temperature and liquid-solid ratio on the yield of flavone extraction

2.1.2 响应面试验优化提取工艺 实际生产中液固比过高会消耗大量溶剂，增大后续浓缩及回收溶剂的操作难度，增加能耗及生产成本，故将液固比(V乙醇∶m分心木)固定为40∶1 (mL/g)。以提取时间、乙醇浓度和提取温度为考察因素，总黄酮提取得率为响应值设计响应面试验，试验因素与水平见表1，结果见表2。

表1 试验因素与水平Table 1 Factors and levels in the experiment

用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合和方差分析，得总黄酮提取得率回归模型：

表2 响应面试验及结果Table 2 Response surface test and results

Q=9.76+0.041A+0.079B-0.22AB-0.14AC+0.10BC-0.70A2-0.75B2-1.34C。

(6)

表3 总黄酮提取得率的回归方程方差分析表†Table 3 Analysis of variance for regression equation of flavonoid extraction yield

AB、AC和BC交互作用对分心木总黄酮提取得率影响的响应面和等高线见图2～4。图2显示，提取时间不变时，总黄酮提取得率随乙醇浓度增加而增加，55%时出现极值后降低；乙醇浓度不变时，总黄酮提取得率随提取时间增加先升高后降低。从图2(b)可看出，等高线呈椭圆形，说明AB交互作用对分心木黄酮提取量的影响较大。图3显示，提取温度比提取时间对分心木总黄酮提取得率的影响大，总黄酮提取得率随温度增加而增加，在80 ℃时出现极值后降低，等高线呈椭圆形，说明AC交互作用对黄酮提取量的影响较大，且图3(b)的等高线没有图2(b)扁平，说明AB交互作用对黄酮提取量的影响大于AC。图4显示，分心木总黄酮提取得率随乙醇浓度的增加先升高后降低，随提取温度的增加而升高。图4(b)的等高线没有图3(b)扁平，说明BC的交互作用没有AB、AC对试验结果影响大。

图2 提取时间和乙醇浓度对总黄酮提取得率的交互影响Figure 2 Interactive effects of extraction time and ethanol concentration on flavone extraction yield

图3 提取时间和提取温度对总黄酮提取得率的交互影响Figure 3 Interactive effects of extraction time and temperature on flavonoid extraction yield

图4 提取温度和乙醇浓度对总黄酮提取得率的交互影响Figure 4 Interactive effects of extraction temperature and ethanol concentration on flavone extraction yield

用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的试验结果进行优化分析，得分心木总黄酮最优提取条件为乙醇浓度55.25%，提取温度80.70 ℃，回流提取时间80.46 min，总黄酮提取得率9.84%。结合实际，将最优提取条件调整为乙醇浓度55%，提取温度80 ℃，回流提取时间80 min。在此条件下，进行3次平行验证实验，总黄酮提取得率9.88%，与预测值较吻合，证明该响应面优化试验结果可靠。有文献[4-5]报道分心木中黄酮提取得率为5.17%～6.70%，低于试验分心木黄酮提取得率，可能是因为不同地区分心木黄酮含量有所差别，或是因为不同提取条件对提取得率有影响。

2.2 分心木总黄酮体外抗氧化活性

图5 分心木总黄酮对自由基的清除作用Figure 5 Free radical scavenging effect of distractive wood flavonoids

2.3 分心木总黄酮对脂变L02肝细胞TC和TG的影响

由表4可知，与正常组相比，模型组TC和TG含量显著升高(P<0.001)，说明脂变L02肝细胞模型建立成功；与模型组相比，阳性药非诺贝特组和分心木总黄酮300，400 μg/mL剂量组的TC和TG含量均显著降低，且分心木总黄酮降低脂变L02肝细胞TC和TG呈剂量效应。试验结果表明，分心木总黄酮降低脂肪变性L02肝细胞TC和TG的活性高。

表4 分心木总黄酮对脂变L02肝细胞TC和TG的影响†Table 4 Effects of distracting flavonoids on TC and TG in Steatosis L02 liver cells

3 结论

试验采用响应面设计法优化云南核桃分心木总黄酮提取最优条件：乙醇浓度55%、提取温度80 ℃、提取时间80 min、液固比(V乙醇∶m分心木)40∶1 (mL/g)，此条件下分心木总黄酮提取得率为9.88%，高于文献[4-5]报道的(5.17%～6.70%)。抗氧化及降低TG、TC的研究发现，云南分心木总黄酮具有较高的抗氧化活性和降低脂肪变性L02肝细胞TC及TG的活性，说明分心木黄酮可开发作为食品、药品、化妆品等行业的天然抗氧化剂，可开发为降脂药物。试验未对分心木总黄酮物质进行纯化分离，未进行分心木总黄酮体内降脂作用研究，后续可采用大孔吸附树脂、硅胶及凝胶进行分离纯化，采用高脂模型大鼠或小鼠进行分心木总黄酮的降脂作用研究，探究分心木黄酮抗氧化及降脂的量效关系、物质基础及作用机制。