响应面—满意度函数优化姜黄郁金多糖和黄酮共提工艺条件及其抗氧化性研究

侯敏娜 侯少平 吴满芳 王 珊 彭修娟 刘 峰 闫欢欢

(1. 陕西国际商贸学院,陕西 咸阳 712046；2. 都昌县第二人民医院，江西 九江 332600；3. 陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710075)

姜黄郁金又称黄丝郁金，为姜黄属植物姜黄(CurcumaLonga)的干燥块根[1]，为常用中药材,具有保肝利胆、降血脂、免疫抑制、抗癌、抗炎、抗氧化、中枢抑制等[2-3]药理作用。郁金不仅可作为行气舒肝解郁、降血脂等的药膳品(如郁金茶、郁金木香茶、郁金清肝茶、荷叶郁金粥等)；还可以用于抗皱、美肤的化妆品领域；其色素已被广泛用作食品和染料的添加剂[4]。郁金含有挥发油、多糖、黄酮、微量元素等[2,5]多种化学成分。目前，有关郁金的研究主要集中于治疗肝病、抑郁症、癫痫、哮喘等作用机制推测[6-10]，挥发油成分分析和含量测定方法[11-12]，以及不同品种郁金化学成分、药理作用分析等[2]方面。而有关郁金多糖、黄酮共提工艺及其药理活性的分析比较研究尚未见报道。

多糖和黄酮类成分在植物中普遍存在，具有抗氧化、防衰老、抗肿瘤等共性特点。其常用提取方法有溶剂提取法、超声提取法、微波提取法等[13]。与其他方法相比，超声提取法具有省时、省溶剂、易操作、廉价等优势[14]；响应面试验以较少的试验次数、较短的提取时间对试验参数进行优化，已被广泛应用于生物、化工及食品加工技术的模型建立及条件优化[15]；满意度函数是一种适合于多目标优化的方法，将不同响应值转化为0～1的无量纲数值，实现了多响应值优化转变为单响应值优化，易于寻求整体最优[16]。

试验拟采用超声提取法，利用响应面—满意度函数法对姜黄郁金多糖和黄酮类成分共提条件进行优化；并以DPPH自由基、ABTS自由基清除率为指标，分析姜黄郁金多糖和黄酮的抗氧化活性，旨在为姜黄郁金多糖和黄酮的深加工及药材资源的广泛、有效利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

姜黄郁金：经陕西中医药大学生药教研室杨新杰教授鉴定为CurcumaLonga的根茎，陕西康宇制药有限公司；

芦丁对照品(批号为100080-201811)、葡萄糖对照品(批号为100082-201803)：中国药品生物制品鉴定所；

DPPH、ABTS：上海源叶生物科技有限公司；

无水乙醇、硫酸、亚硝酸钠、苯酚、硝酸铝、过硫酸钾、维生素C：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机：FW-100型，北京科伟永兴仪器有限公司；

电子分析天平：YP2102型，北京赛多利斯仪器有限公司；

数控超声波提取器：KQ5200型，昆山市超声仪器有限公司；

循环水式多用真空泵：SHB-111型，郑州长城科工贸有限公司；

紫外—可见分光光度计：TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 预处理 将姜黄郁金于50 ℃干燥，粉碎，过5号筛，封存。

1.3.2 标准曲线绘制

(1) 葡萄糖标准曲线：准确称取于105 ℃干燥后的葡萄糖标准品5.032 mg，用纯化水定容至50 mL，摇匀，得浓度为0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液。参照硫酸—苯酚法[16-18]制作标准曲线，得回归方程为y=6.262 5x-0.012 8，R2=0.994 8。

(2) 芦丁标准曲线：准确称取于105 ℃干燥后的芦丁标准品5.069 mg，用50%乙醇定容至25 mL，摇匀，得浓度为0.2 mg/mL芦丁标准溶液。参照文献[19]制作标准曲线，得回归方程为y=1.891 0x+0.003 5，R2=0.997 4。

1.3.3 多糖和黄酮提取率测定 根据1.3.2方法进行测定，按式(1)计算姜黄郁金多糖和黄酮提取率。

Y=[(C×V×N)/M]×100%，

(1)

式中：

Y——姜黄郁金多糖或黄酮提取率，%；

C——姜黄郁金多糖或黄酮质量浓度，mg/mL；

V——姜黄郁金多糖或黄酮体积，mL；

N——稀释倍数；

M——药材质量，mg。

1.3.4 满意度函数 以姜黄郁金多糖和黄酮提取率为响应值，按式(2)转化为无量纲的期望值di(0≤di≤1)，d越接近1，效果越好。将多个响应值的wn次方根的积作为满意度值D[16,19]，并按式(3)进行计算。

(2)

(3)

式中：

Yi(x)——第i个指标的响应值；

Ymax,i、Ymin,i——最高、最低响应值；

将姜黄郁金多糖提取率设为Y1，黄酮提取率设为Y2，经查阅文献[16,20]得知姜黄郁金多糖的最高提取率为1.151%，最小为0.000%；黄酮的最高提取率为0.314%，最小为0.000%。w1设为0.6，w2设为0.4，得满意度D。利用响应面软件对满意度进行分析，满意度对应最大值的提取工艺即为最优提取条件。

1.3.5 单因素试验

(1) 乙醇体积分数：在料液比(m姜黄郁金∶V水)1∶20 (g/mL)，超声时间20 min，超声温度50 ℃下，考察乙醇体积分数(0%，20%，40%，60%)对姜黄郁金黄酮和多糖提取率的影响。

(2) 料液比：在提取溶剂为水，超声时间20 min，超声温度50 ℃下，考察料液比[m姜黄郁金∶V水分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40 (g/mL)]对姜黄郁金黄酮和多糖提取率的影响。

(3) 超声时间：在提取溶剂为水，料液比(m姜黄郁金∶V水)1∶20 (g/mL)，超声温度50 ℃下，考察超声时间(15，20，25，30 min)对姜黄郁金黄酮和多糖提取率的影响。

(4) 超声温度：在提取溶剂为水，料液比(m姜黄郁金∶V水)1∶20 (g/mL)，超声时间20 min下，考察超声温度(30，40，50，60 ℃)对姜黄郁金黄酮和多糖提取率的影响。

1.3.6 响应面试验设计 在单因素试验基础上，以姜黄郁金黄酮和多糖提取率的满意度为评价指标进行响应面试验设计，优选最佳提取工艺条件。

1.3.7 姜黄郁金多糖和黄酮抗氧化能力测定

(1) 对DPPH自由基的清除能力：参照文献[21-23]并修改，分别配置浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的姜黄郁金多糖和黄酮样品溶液。移取2 mL不同浓度的两种样品溶液，各加入2 mL DPPH溶液，摇匀，暗处反应30 min，测定517 nm处吸光度。以无水乙醇为空白对照，按式(4)计算自由基清除率。

(4)

式中：

K——自由基清除率，%；

Ai——样品组吸光度；

Aj——样品对照组吸光度；

A0——空白对照组吸光度。

(2) 对ABTS自由基的清除能力：参照文献[23-24]并修改，测定734 nm处吸光度。以无水乙醇为空白对照，按式(4)计算自由基清除率。

1.3.8 数据处理 采用Excel 2007软件制作图表，用Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1可知，当提取溶剂为水时，姜黄郁金多糖和黄酮提取率均达最高，说明姜黄郁金多糖和黄酮极性偏大，在水中溶解度最好；当料液比(m姜黄郁金∶V水)为1∶20 (g/mL)时，两者提取率均达最高，随着溶剂的增加，大部分水溶性杂质浸出，阻止目标成分溶出，提取率降低；当超声时间为20 min 时，姜黄郁金多糖提取率达最高，而黄酮提取率在15～20 min下降比较缓慢，超过20 min后下降较明显，可能是由于随着超声时间的延长，超声波的振荡作用破坏了姜黄郁金中小分子多糖和黄酮类成分，使提取率降低；当提取温度为50 ℃时，姜黄郁金多糖和黄酮提取率均达最大，随着超声温度的升高，小分子姜黄郁金黄酮和多糖成分发生分解或改变，提取率降低。故姜黄郁金多糖和黄酮共提条件为：以水为提取溶剂、料液比(m姜黄郁金∶V水)1∶20 (g/mL)、超声时间20 min、超声温度50 ℃。

图1 各因素对姜黄郁金多糖及黄酮共提得率的影响Figure 1 Effect of different factors on the co-extraction rate of polysaccharides and flavonoids from Curcuma Longa

2.2 姜黄郁金多糖和黄酮共提工艺优化

2.2.1 响应面试验设计与结果 根据Box-Benhnken中心组合试验设计原则结合单因素试验结果，以姜黄郁金多糖和黄酮提取率的满意度为响应值，选取料液比、超声时间、超声温度为因素，进行三因素三水平的响应面分析试验，因素水平见表1，试验设计与结果见表2。

表1 试验因素水平表Table 1 Experimental factor level table

2.2.2 回归方程的建立与方差分析 对表2进行多元回归拟合，得到二次回归方程：

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design of response surface experiment scheme

D=0.80+0.055A-0.066B+0.046C+9.675E-003AB-4.250E-003AC+0.048BC-0.28A2-0.089B2-0.11C2。

(5)

表3 方差分析†Table 3 Analysis of variance

2.2.3 响应面分析 由图2可知，姜黄郁金多糖和黄酮共提满意度随超声时间和超声温度的延长呈先升高后下降趋势，但变化缓慢，等高线图略偏圆形，说明二者交互作用不显著；料液比和超声时间交互作用的曲面较陡，说明其对姜黄郁金多糖和黄酮共提满意度影响较大，等高线图近似椭圆形，说明两因素与响应值之间交互作用影响较大；料液比和超声温度交互作用的等高线图呈椭圆形，说明二者与响应值之间交互作用显著。综上，姜黄郁金多糖和黄酮共提条件范围：超声温度45～55 ℃，料液比(m姜黄郁金∶V水) 1∶20～1∶25 (g/mL)，超声时间15～25 min。

图2 各因素交互作用对姜黄郁金多糖和黄酮共提满意度的影响Figure 2 The satisfaction of Curcuma Longa polysaccharides and flavonoids co-extraction with different factors

2.3 工艺验证

经求导可得，姜黄郁金多糖及黄酮共提取的最佳工艺条件为：超声温度50 ℃，料液比(m姜黄郁金∶V水)1.0∶22.3 (g/mL)，超声时间20 min，此时的预测满意度为0.826 3，姜黄郁金多糖提取率为1.04%，黄酮提取率为0.25%。考虑实际的可操作性，将姜黄郁金多糖及黄酮共提条件调整为：超声温度50 ℃，料液比(m姜黄郁金∶V水)1∶22 (g/mL)，超声时间20 min。通过3次平行实验验证，最佳工艺条件下的满意度为0.823 7，与预测值相差极小，说明运用该试验分析方法得出的提取工艺可靠、可行，此时多糖提取率为1.01%，黄酮提取率为0.23%。

2.4 姜黄郁金多糖和黄酮的抗氧化性

由图3可知，姜黄郁金多糖和黄酮对DPPH自由基、ABTS自由基具有一定的清除能力，但两者作用效果都明显弱于维生素C，且黄酮对两种自由基的清除能力强于多糖，这与黄酮类属于多酚化合物，是天然抗氧剂有关。当姜黄郁金粗多糖和黄酮质量浓度为2 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除能力达最大，分别为(42.91±0.54)%，(65.46±0.38)%。当多糖质量浓度为2 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除能力达最大，为(33.28±0.69)%；当黄酮质量浓度为1.5 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除能力达最大，为(34.26±0.18)%。

图3 姜黄郁金多糖、黄酮及维生素C对自由基的清除能力Figure 3 The scavenging ability of Curcuma Longa polysaccharides, flavonoids and VC to different free radicals

3 结论

试验表明，姜黄郁金多糖及黄酮共提条件为：以水为提取溶剂、超声温度50 ℃、料液比(m姜黄郁金∶V水)1∶22 (g/mL)、超声时间20 min，此时姜黄郁金多糖、黄酮提取率分别为1.01%，0.23%，满意度为0.823 7。在抗氧化作用的浓度范围内，当姜黄郁金多糖和黄酮质量浓度为2 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除能力均达最大，分别为(42.91±0.54)%，(65.46±0.38)%；当多糖质量浓度为2 mg/mL 时，其对ABTS自由基的清除能力达最大，为(33.28±0.69)%；当黄酮质量浓度为1.5 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除能力达最大，为(34.26±0.18)%，说明姜黄郁金多糖和黄酮具有较好的清除自由基能力，且黄酮的清除能力强于多糖。姜黄郁金多糖和黄酮成分组成较多且复杂，而抗氧化活性可能是其中一种或几种成分发挥作用，其具体功能成分物质有待于后续研究。