透明质酸移植液对既往种植失败患者解冻妊娠结局的影响①

巩晓芸，王致辉，艾海权

（新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心，乌鲁木齐830054）

目前人类辅助生殖技术从飞速发展转向安全有效的应用研究，但每移植周期胚胎着床率低导致卵巢刺激风险增加和卵子大量浪费依然是面临的主要难题[1]。胚胎着床是多因素协同作用的复杂过程，涉及胚胎-子宫内膜和物理-生化免疫等方面，有研究显示移植时抑制胚胎活动、增强胚胎血管侵袭力能改善妊娠结局，而胚胎移植液作为胚胎着床过程中微环境，其成分及含量与胚胎着床密切相关[2]。已有研究发现，透明质酸（hyaluronic acid,HA）广泛存在于人体生殖道分泌物及细胞外基质中，通过与子宫内膜受体CD44结合协助胚胎-子宫内膜相互容受[3-4]。目前富含HA的移植液已在临床使用，有临床数据显示能提高妊娠率及活产率，但也有研究表明常规应用HA移植液并不能改善所有类型妊娠结局[5]。本研究采用回顾性分析探讨既往种植失败人群使用富含HA移植液能否改善解冻周期妊娠结局。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取2014年7月-2015年6月在新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心行解冻移植的患者。纳入标准：（1）解冻复苏周期；（2）既往至少胚胎种植失败1次；（3）至少有1枚胚胎可供移植。排除标准：（1）新鲜移植周期；（2）近3个月使用过激素类药物；（3）内生殖器器质性病变，如子宫内膜异位症或子宫腺肌症；（4）有高血压、糖尿病或全身性疾病。将患者分为HA组（采用瑞典Vitrolife公司的EmbryoGlue液移植）和非HA组（采用瑞典Vitrolife公司的G-2 PLUS液移植）。

1.2 研究方法（1）解冻周期内膜准备。人工周期:综合月经周期第2天超声及基础内分泌结果，无明显异常后开始给予口服雌二醇(4～6mg／d)，用药12～14d且内膜厚度达到8.0mm以上开始添加黄体支持转化内膜；转化当日算D0，于D3进行卵裂期胚胎移植或D5进行囊胚移植。自然周期：综合月经周期第2天超声及基础内分泌结果，于月经8～11d开始超声监测卵泡发育情况，结合孕酮、促黄体生成素及雌激素水平确定具体排卵日开始添加黄体支持，排卵日算D0，于D3进行卵裂期胚胎移植或D5进行囊胚移植。（2）胚胎冷冻和解冻。采用快速玻璃化法，使用成品冷冻解冻保护剂套装（美国Irvine Scientific公司）。玻璃化冷冻：全程室温下操作，将胚胎转移至平衡液（ES）中，静置7min，卵裂球皱缩后完全膨胀转移至玻璃化液（VS）中，60s内胚胎装载至冷冻载体上，迅速投入液氮，套上外管套。玻璃化解冻：将冷冻载体从液氮中迅速取出，拔除外套管，插于37℃解冻液（TS）中静置1min，然后转移至室温的稀释液（DS）中静置4min，再转移至室温的洗液（WS）中静置8min，最后转入盖油的胚胎培养皿中，于37℃、6%CO2培养箱中至少培养2h。卵裂球存活≥50%视为胚胎复苏。（3）胚胎移植。将胚胎放入已平衡过夜的HA移植液或非HA移植液中，使用胚胎专用移植管（COOK公司），胚胎放在距离宫底1～1.5cm处，移植后继续给予黄体支持治疗。

1.3 随访及结果判定移植后28d行临床妊娠随访，B超检查宫内或附件区见明确孕囊者确定为临床妊娠。临床妊娠率=B超见孕囊的周期数/移植周期数×100%，着床率=孕囊总数/移植胚胎总数×100%（单卵多胎孕囊数为1），多胎妊娠率≥2个孕囊的周期数/临床妊娠周期数×100%，流产率=20周前流产的周期数/临床妊娠周期总数×100%，异位妊娠率=异位妊娠的周期数/临床妊娠周期总数×100%，活产率=活胎分娩周期数/移植周期数×100%。

1.4 统计学方法使用SPSS18.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，行正态分布及方差齐性检验，组间定量资料采用t检验；计数资料率及构成比采用百分率（%）表示，比较采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的基本情况比较共纳入460例患者，其中203例采用HA移 植液，257例采用非HA移植液。两组基本情况各个指标差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 两组患者妊娠结局比较两组临床妊娠率、活产率、种植率、多胎妊娠率、流产率、异位妊娠率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1两组基本情况比较

表2两组妊娠结局比较/%

2.3 两组主要结局指标的亚组分析HA组解冻囊胚临床妊娠率高于对照组（55.00%vs44.12%，P＜0.05），年龄、移胚个数、是否辅助孵化（AH）及既往移植失败次数两组差异无统计学意义，见表3。在活产率方面，两组在各指标间差异均无统计学意义，见表4。

表3两组临床妊娠率亚组比较/%

表4两组活产率亚组比较/%

3 讨论

在过去的几十年里，伴随着卵巢超促排方案和胚胎培养方法的显著进步，可以获得更多的卵母细胞、更好的受精率和更多的优质胚胎，使人类辅助生殖技术的成功率显著提高。通过改善着床微环境，提高胚胎着床率进而提高卵子和胚胎的利用效率，是目前辅助生殖技术安全有效发展的趋势。胚胎着床是复杂定位识别粘附子宫内膜的过程，研究显示抑制移植胚胎物理运动，增强胚胎血管侵袭能力有利于着床[2]。富含HA移植液能通过CD44受体介导间接促进血管生成，增加细胞间粘附和细胞间基质粘附，为胚胎提供高粘度的宫腔环境，促进着床并抑制移植后胚胎从宫腔排出，提高胚胎着床率[6]。

2项大型前瞻性试验表明，使用HA移植液可增加着床率和临床妊娠率[7-8]；而另一项随机试验提出，使用HA移植液确实可提高生化妊娠率和着床率，但不增加活产[9]；也有一项meta分析比较了含有不同浓度HA的移植液，得出高浓度组可显著提高临床妊娠率[8]；因此，使用富含HA移植液能否改善患者的妊娠结局仍存在争议，HA移植液该如何使用，针对何种患者尚未达成共识。

本研究通过回顾性分析460例既往种植失败患者再次解冻移植过程，比较含HA与否移植液对解冻妊娠结局的影响，发现着床率、活产率、临床妊娠率、多胎妊娠率及异位妊娠率方面差异均无统计学意义。但通过亚组分析，移植解冻囊胚使用HA移植液组临床妊娠率高于非HA移植液组，两组差异有统计学意义。HA移植液针对改善胚胎着床微环境而设计，理论上对既往种植失败患者有更好效果，然而本研究并未发现这一点，这可能和如下因素有关：（1）本研究是回顾性研究，且样本量偏小，结果偏倚较大；（2）对于既往种植失败患者，其子宫内膜与胚胎的协调性本身不一致，而HA在移植过程中效果有限，尚达不到改善同步性的效果。辅助生殖治疗的主要目标是分娩健康的婴儿，一项meta分析发现：HA浓度高能增加8%的活产率[10]，本研究中并未显示HA增加活产的优势，本研究中解冻囊胚移植亚组，两组临床妊娠率有显著差异，这与Balakier等[11]的研究一致，这间接证实CD44受体直到囊胚期才能形成，HA可以使胚胎与子宫内膜相互作用，然而胚胎着床后稳定性相对较差，而流产率相对较高，故两组活产率差异无统计学意义，与既往文献[12-13]的研究结论一致。

由于HA移植液临床应用有限，回顾性研究不可避免样本量局限、选择偏差、干扰因子等问题，故本研究无法将一些关键因素进行匹配，如超促排方案、Gn剂量和黄体支持等。根据本研究结果对于既往种植失败患者，HA移植液能提高解冻囊胚临床妊娠率，但未能改善卵裂期胚胎解冻妊娠结局，且会增加患者经济负担，因此增加研究样本量、设计前瞻性、多中心联合研究来进一步观察其应用效果，以期为临床提供更可靠的应用理论依据。