山药麸炒前后有效成分含量及UPLC指纹图谱差异性研究

王碧君，黄上书，梁慧，杨文惠，罗宇琴，孙冬梅，陈向东

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

山药为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb. 的干燥根茎，主要分布于山西，河北安国，陕西朝邑、华县、同州，河南新乡等地，以河南为道地产区。山药作为药食两用佳品，味甘，性平，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精之功，临床用于脾虚食少、肺虚喘咳、肾虚遗精、虚热消渴等症[1]。山药生品长于补虚，麸炒后健脾和胃功效增强，临床上麸炒山药主要作为滋阴或补阳的臣药，功偏补益[2-6]。现代研究表明，山药主要含有山药多糖、黄酮、山药碱、尿囊素、腺苷、甾体化合物等成分[7-8]，具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤、降血糖的作用。

目前，2015年版《中国药典》对山药的质量控制缺乏有效成分的限定，本研究对不同产地山药及其麸炒品进行研究，建立山药和麸炒山药饮片尿囊素的HPLC含量测定方法，及山药和麸炒山药饮片UPLC指纹图谱方法及腺苷的含量测定方法，并结合相似度分析对山药及其炮制品的指纹图谱差异进行评价，为全面评价山药的质量提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪；Waters H-class超高效液相色谱仪；ME204E万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；XP26百万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)、甲醇(广东光华科技股份有限公司)为分析纯；乙腈(默克股份有限公司)、磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)为色谱纯；水为超纯水(实验室自制)。腺苷(批号110879-201703，质量分数99.7%，中国食品药品检定研究院)；尿囊素(批号111501-200202，质量分数100%，中国食品药品检定研究院)；麸皮(批号FH1810001，温县三方农贸有限公司)。

10批山药生品来源于全国不同产地，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎。麸炒山药为同批山药的炮制加工品，炮制工艺：每100 kg山药片用麸皮10～15 kg。样品采集信息见表1。

2 方法与结果

2.1 山药及麸炒山药指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：YMC Triart 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～4 min，1%A；4～10 min，1%→3%A；10～25 min，3%→20%A)；流速：0.20 mL/min；柱温：30 ℃，检测波长：258 nm；进样量：1 μL。

表1 样品信息

2.1.2 供试品溶液的制备 取饮片粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入10%(体积分数，下同)甲醇15 mL，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，离心，取上清液，残渣再加入10%甲醇10 mL，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，离心，合并2次上清液，定容至25 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备 取腺苷对照品适量，加10%甲醇制成质量浓度为0.227 mg/mL的对照品溶液。

2.1.4 精密度试验 日内精密度：取同一批饮片粉末(S1)，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项色谱条件连续进样6次，以1号腺苷色谱峰为参照峰S，计算得到各共有峰相对峰面积及相对保留时间RSD值均小于1.0%，表明仪器精密度良好。日间精密度：取同一批饮片粉末(S1)，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，分别在不同日期内按“2.1.1”项色谱条件进样测定，以腺苷峰为参照峰S，计算得到各共有峰相对峰面积及相对保留时间RSD值均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取同一批饮片粉末(S1)，按“2.1.2”项方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1.1”项色谱条件依此进样测定，以腺苷峰为参照峰S，计算得到各共有峰相对峰面积及相对保留时间RSD值均小于2.0%，表明方法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一批饮片粉末(S1)，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，以腺苷峰为参照峰S，计算得到各共有峰相对峰面积及相对保留时间RSD值均小于2.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 UPLC指纹图谱的建立 取上述10批山药生品和10批麸炒山药饮片，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项色谱条件测定。使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行分析，采用多点校正后进行自动匹配(时间窗0.1 min)，提取吸收信号较强、峰形明显、稳定性较好的共有峰，按中位数法生成对照图谱，结果见图1～4。

根据数据分析，10批山药生品标定了4个共有峰，10批麸炒山药饮片标定了7个共有峰，2号峰为腺苷峰，其分离度良好，峰面积较大，在图谱中较稳定且为所有样品共有，所以确定腺苷为参照峰(S)。

图1 10批山药生品的UPLC叠加图谱

2.1.8 指纹图谱相似度计算 分别通过10批山药和麸炒山药生成的共有模式为对照指纹图谱，计算各批次之间的相似度，结果见表2。可见，10批次山药生品与对照指纹图谱的相似度范围为0.997～1.000，10批次麸炒山药饮片与对照指纹图谱的相似度范围为0.950～0.999，表明山药与麸炒山药质量稳定，生品与生品、炮制品与炮制品之间组内组成成分差异小。

图2 10批麸炒山药样品的UPLC叠加图谱

图3 山药生品对照指纹图谱

图4 麸炒山药样品对照指纹图谱

2.1.9 山药麸炒前后UPLC指纹图谱比较 取炮制用辅料麸皮，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项色谱条件测定，将图谱结果与上述山药、麸炒山药UPLC指纹图谱进行比较，结果见图5。

表2 山药生品及麸炒山药饮片相似度

图5 山药麸炒前后UPLC指纹图谱比较

可见，麸炒后的山药图谱由5个共有峰增加至8个共有峰，其主要差异在a、b、c 3个区域。其中，a所示区域麸炒品中明显增加了峰3，而山药生品在该积分条件下未能识别，且辅料麦麸中响应极低；b所示区域麸炒品中明显增加了峰5，而山药生品在该积分条件下未能识别，且辅料麦麸中无响应；c所示区域麸炒品中明显增加了峰8，而山药生品在该积分条件下未能识别，且辅料麦麸中响应较低，进一步说明了麸炒前后山药与麸炒山药差异较大，表明该指纹图谱方法能应用于山药与麸炒山药的质量控制。

2.2 腺苷质量分数的测定方法

2.2.1 供试品溶液的制备 同“2.1.2”项下方法。

2.2.2 对照品溶液的制备 同“2.1.3”项下方法。

2.2.3 色谱条件 同“2.1.1”项下色谱条件。分别精密吸取腺苷对照品、山药(S1)供试品和麸炒山药(S11)供试品溶液 1 μL，进样测定，色谱图见图6。

A.腺苷对照品； B.山药样品； C.麸炒山药样品； 1.腺苷。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液适量，分别置10 mL容量瓶中，用10%甲醇稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度分别为0.114、0.056 8、0.022 7、0.005 68、0.002 27、0.001 14 mg/mL的对照品溶液，按“2.2.3”项色谱条件进样，记录色谱峰面积；以对照品质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，得回归方程y=1.590×107x- 2.389×103，r=0.999 9，线性范围为0.00 114～0.114 mg/mL。

2.2.5 精密度试验 日内精密度：取同一批饮片粉末(S1)，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，并按“2.2.3”项色谱条件连续进样6次，计算得到腺苷峰面积RSD值为0.37%，表明仪器精密度良好。日间精密度：取同一批饮片粉末(S1)，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，分别在不同日期内按“2.2.3”项色谱条件进样测定，计算得到腺苷峰面积RSD值为1.18%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批饮片粉末(S1)，按“2.2.1”项方法平行制备6份供试品溶液，分别进行测定，连续进样6次，计算得到腺苷的质量分数为0.337 mg/g，RSD值为0.37%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取同一批供试品溶液(S1)，按“2.2.3”项色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，计算得到腺苷峰面积的RSD值为0.71%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.8 回收率试验 取同一批(S1号)已知含量的样品约0.25 g，精密称定，按高、中、低3种浓度分别加入腺苷对照品溶液，分别“2.2.1”项方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项色谱条件分别进样测定，计算回收率。计算得到腺苷平均加样回收率分别为104.65%，结果见表3。

表3 腺苷加样回收率试验结果

2.3 尿囊素质量分数的测定方法

2.3.1 供试品溶液的制备 取饮片粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称定质量，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，用稀乙醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备 取尿囊素对照品适量，加稀乙醇使溶解，定容至刻度，制成2.497 mg/mL尿囊素对照品储备溶液。

2.3.3 色谱条件 色谱柱：Waters SPHERISORB NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相：乙腈-水(体积比90∶10)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：224 nm；进样量：10 μL。分别精密吸取尿囊素对照品、山药(S1)供试品和麸炒山药(S11)供试品溶液 10 μL，进样测定，色谱图见图7。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”项对照品溶液适量，分别置5、10、10、20、10、25 mL容量瓶中，用稀乙醇稀释至浓度，摇匀，制得质量浓度分别为1.248、0.624、0.250、0.125、0.075、0.030 mg/mL的对照品溶液，分别按“2.3.3”项色谱条件进样，记录色谱峰面积；以对照品质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，得线性回归方程y=1.824×106x+2.800×103，r=0.999 9，线性范围为0.030 0～1.248 mg/mL。

2.3.5 精密度试验 日内精密度：取同一批饮片粉末(S1)，按“2.3.1”项方法制备供试品溶液，并按“2.3.3”项色谱条件连续进样6次，计算得到尿囊素峰面积RSD值为1.01%，表明仪器精密度良好。日间精密度：取同一批饮片粉末(S1)，按“2.3.1”项方法制备供试品溶液，分别在不同日期内按“2.3.3”项色谱条件进样测定，计算得到尿囊素峰面积RSD值为1.28%，表明仪器精密度良好。

A.尿囊素对照品； B.山药样品； C.麸炒山药样品； 2.尿囊素。

2.3.6 重复性试验 取同一批饮片粉末(S1)，按“2.3.1”项方法平行制备6份供试品溶液，分别进行测定，连续进样6次，计算得到尿囊素的质量分数为6.997 mg/g，RSD值为0.72%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 精密吸取同一批供试品溶液(S1)，按“2.3.3”项色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，计算得到尿囊素峰面积的RSD值分别为1.03%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.8 回收率试验 取同一批(S1号)已知含量的样品约0.25 g，精密称定，按高、中、低 3 种浓度分别加入尿囊素对照品溶液，分别按“2.3.1”项方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项色谱条件分别进样测定，计算回收率。结果计算得到尿囊素的平均加样回收率分别为 96.17%，见表4。

2.4 样品测定

基于上述建立的腺苷及尿囊素的质量分数测定方法，对10批山药和10批麸炒山药样品进行测定，计算样品中的腺苷、尿囊素的质量分数，结果见表5。可见，山药生品、麸炒山药饮片中腺苷的质量分数分别为0.196～0.421、0.260～0.410 mg/g，尿囊素的质量分数分别为6.200～9.160、6.240～8.340 mg/g。

运用SPSS22.0软件对山药生品和麸炒山药尿囊素、腺苷质量分数测定结果进行独立样本t检验，结果见表6。可见，山药炒制前后尿囊素、腺苷含量差异无统计学意义。

表4 尿囊素加样回收率试验结果

表5 山药生品及麸炒山药饮片中腺苷与尿囊素的质量分数测定结果

表6 山药及麸炒山药腺苷、尿囊素含量独立样本检验结果

3 讨论

本文对山药及麸炒山药的含量测定方法及指纹图谱进行了研究，建立了山药和麸炒山药饮片UPLC指纹图谱方法，可同时测定腺苷的质量分数。由于尿囊素极性较大，在反相色谱柱上保留时间极短，参考文献[9-10]选用氨基柱进行研究，考察不同乙腈-水比例对尿囊素分离度的影响，当乙腈-水比例为(体积比90∶10)时，能较好分离得到样品中的尿囊素。

曾对不同提取方法(超声、回流)及不同提取溶剂(甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、稀乙醇)进行考察，结果发现采用10%甲醇超声提取的色谱图信息量最多，峰响应较高，且腺苷提取较充分，故选用10%甲醇超声提取腺苷及指纹图谱；采用稀乙醇超声提取时，尿囊素提取较充分，故选用稀乙醇超声提取尿囊素。

麦麸含有黄酮类、尿囊素等多种成分，炮制过程可能会对山药中尿囊素质量分数产生影响[11]，而本文结果显示麸炒后尿囊素、腺苷质量分数变化不明显，可能与麦麸在炒制过程中，麦麸起中间传热作用有关。杨连菊等[12]发现麸炒前后山药中的尿囊素质量分数差异不大，与本文结论一致。另外，刘应蛟等[13]比较不用炮制方法对山药尿囊素、腺苷质量分数的影响，发现麸炒后尿囊素、腺苷质量分数变化不明显，而土炒后显著增大，后续将对不同炮制方法下山药有效成分的变化情况进行研究。

本研究试验过程中发现，麸炒后山药特征峰数量增多，说明麸炒后山药的成分出现一定的变化，在炮制辅料麦麸中能找到其增加3号、7号和8号色谱峰，不能找到5号色谱峰，说明麸炒后增加的3号、7号和8号色谱峰可能由麦麸带入；而增加的5号色谱峰，可能因加热引起某些成分的转化。结合炒制前后质量分数结果，推测麸制后补益作用的增强可能不依赖尿囊素、腺苷质量分数的增加，而麸炒的作用可能使二者的质量分数维持在一定范围内发挥作用。另外，山药归脾、肺、肾经，而麦麸含有丰富的氨基酸等成分，麸制后可能作为引经药促进山药对脾胃的亲和力，增强其补脾益肺的功效。